Возможность репрограммирования генома млекопитающих активно исследуется более полувека. В 1962 г. Гёрдон впервые показал возможность репрограммирования генома дифференцированной клетки факторами энуклеированного ооцита. В 2006 г. Яманака получил индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) мыши из фибробластов с помощью всего лишь четырех транскрипционных факторов: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc. Получение ИПСК поставило вопрос о полноте репрограммирования: остаются ли активными гены, экспрессирующиеся в исходных фибробластах? И насколько характеристики ИПСК соответствует эмбриональным стволовым (ЭС) клеткам, которые в данном случае являются стандартом. В настоящее время ИПСК получены для десятков видов животных, однако ЭС клетки – менее чем для двадцати. В 1993 г. в Институте цитологии и генетики СО РАН были получены ЭС клетки ценного пушного зверя – американской норки (Neovison vison), благодаря чему появилась уникальная возможность сравнить индуцированные и полученные из эмбриона плюрипотентные клетки. В 2015 г. нами получены ИПСК американской норки и показано репрограммирование генома фибробластов на уровне анализа экспрессии генов: часть генов была успешно репрограммирована, часть имела промежуточную между фибробластами и ЭС клетками экспрессию, часть не репрограммировалась, и наконец, присутствовали гены, экспрессия которых отличалась от обоих типов клеток. Таким образом, еще для одного вида животных стало возможным изучать плюрипотентность и дифференцировку на двух типах плюрипотентных клеток: ЭС и ИПСК. В настоящей статье представлен подробный протокол получения ИПСК американской норки с использованием векторов, несущих гены OCT4, KLF4, SOX2 и cMYC человека. Кратко описан необходимый набор методов анализа: морфология ИПСК, цитогенетический анализ, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией на присутствие «маркирующих» плюрипотентность генов и тест на формирование тератом в иммунодефицитных мышах. Данный протокол позволяет воспроизводимо и эффективно получать ИПСК из фибробластов американской норки.
Mammalian genome reprogramming has been studied for more than half a century. First, Sir John Gurdon showed the possibility of differentiated cell genome reprogramming by enucleated oocyte factors in 1962. Dr. Shinya Yamanaka produced induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse fibroblasts by the use of just four transcription factors in 2006: Oct4, Klf4, Sox2, and c-Myc. Generation of iPS cells put a question about the reprogramming completeness: do genes derived from fibroblasts retain their expression? And are the features of iPS cells in compliance with those of embryonic stem (ES) cells that serve as a standard? To date, iPS cells have been produced for tens of species, while ES cells, for less than twenty. In 1993 American mink (Neovison vison) ES cells were produced in the Institute of Cytology and Genetics SB RAS. That created a unique opportunity for comparison of induced and embryo-derived pluripotent cells. In 2015 we produced American mink iPS cells and showed fibro-blast genome reprogramming at the level of gene expression and divided genes into four groups: reprogrammed, with intermediate expression, non-reprogrammed, and the ones with a “novel” expression pattern. Thus, an opportunity to study pluripotency and differentiation on two pluripotent cell types, ES and iPS cells, was added for one more species. In this article we present a detailed protocol for generation of American mink iPS cells with human OCT4, KLF4, SOX2, and cMYC genes. In addition, we briefly describe necessary methods for their analysis: morphology, cytogenetic analysis, PCR with reverse transcription for the presence of pluripotency “marker” genes, and teratoma formation test in immunodeficient mice. This protocol allows reliable and efficient generation of American mink iPS cells from embryonic fibroblasts.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.