vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/VJ17.292vavilov-1222Research ArticleГЕНОМИКА И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯGENOMICS AND GENE ENGINEERINGСравнительный анализ активности лактаптина, полученного в про- и эукариотических системах экспрессииComparative analysis of lactaptin activity when produced in bacterial or eukaryotic expression systemsКовальО. А.KovalO. A.

Новосибирск.

Novosibirsk.

o.koval@niboch.nsc.ruВолковаО. Ю.VolkovaO. Y.

Новосибирск.

Novosibirsk.

ГорчаковА. А.GorchakovA. A.

Новосибирск.

Novosibirsk.

КулемзинС. В.KulemzinS. V.

Новосибирск.

Novosibirsk.

ТкаченкоА. В.TkachenkoA. V.

Новосибирск.

Novosibirsk.

НуштаеваА. А.NushtaevaA. A.

Новосибирск.

Novosibirsk.

КулигинаЕ. В.KuliginaE. V.

Новосибирск.

Novosibirsk.

РихтерВ. А.RichterV. A.

Новосибирск.

Novosibirsk.

ТаранинА. В.TaraninA. V.

Новосибирск.

Novosibirsk.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский государственный университет.РоссияInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University.Russian FederationИнститут молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук.РоссияInstitute of Molecular and Cellular Biology SB RAS.Russian FederationНовосибирский государственный университет; Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук.РоссияNovosibirsk State University; Institute of Molecular and Cellular Biology SB RAS.Russian FederationИнститут химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук.РоссияInstitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS.Russian Federation201722122017217764769Copyright © Коваль О.А., Волкова О.Ю., Горчаков А.А., Кулемзин С.В., Ткаченко А.В., Нуштаева А.А., Кулигина Е.В., Рихтер В.А., Таранин А.В., 20172017Коваль О.А., Волкова О.Ю., Горчаков А.А., Кулемзин С.В., Ткаченко А.В., Нуштаева А.А., Кулигина Е.В., Рихтер В.А., Таранин А.В.Koval O.A., Volkova O.Y., Gorchakov A.A., Kulemzin S.V., Tkachenko A.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Richter V.A., Taranin A.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/1222

Несмотря на множество цитостатических противораковых агентов, имеющихся в арсенале онкологов в настоящее время, все эти препараты обладают значительными побочными эффектами, что может ограничивать их использование для некоторых пациентов. В связи с этим создание новых противораковых препаратов на основе селективных индукторов апоптоза, способных подавлять рост опухоли без повреждения здоровых клеток организма, – актуальная задача молекулярной медицины. Ранее было показано, что белок лактаптин, фрагмент частичного протеолиза каппаказеина из молока человека, индуцирует гибель раковых клеток в культуре, а его генно-инженерный аналог (RL2), продуцируемый в клетках E. coli, вызывает торможение роста солидных опухолей. Так как лактаптин является фрагментом человеческого белка, он не иммуногенен и может применяться многократно без риска индукции специфического иммунного ответа, снижающего эффективность терапии. Мы обнаружили, что рекомбинантный аналог лактаптина в комбинации с циклофосфамидом оказывает аддитивный противоопухолевый эффект. Целью настоящей работы было создание рекомбинантного лактаптина с повышенной цитотоксической активностью за счет его продукции в эукариотических клетках. На основе лентивирусного вектора серии pCDH созданы конструкции pEL1 и pEL2, которые обеспечивают стабильную интеграцию кассет, кодирующих секретируемые формы лактаптина EL1 и EL2, отличающиеся лидерными последовательностями. Продукция целевых белков подтверждена методом Вестерн-блота; количество продуцируемого белка оценивали методом иммуноферментного анализа. Цитотоксическая активность кондиционированной среды от клеток HEK293T, трансфицированных препаратом плазмиды pEL1, проанализирована в отношении панели опухолевых клеток человека: аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231, рака простаты PC3 и глиобластомы T98G. Обнаружено, что цитотоксическая активность рекомбинантного аналога лактаптина EL1 превышает цитотоксическую активность RL2 более чем в 100 раз. Таким образом, полученные данные позволяют переходить к использованию иммунных клеток в качестве доставщиков лактаптина к раковым клеткам для клеточной терапии онкологических заболеваний.

Despite the multitude of anticancer cytostatic drugs available to oncologists today, most of such drugs have serious side effects that may preclude their use in some groups of patients. Hence, selective induction of apoptosis in cancer but not normal cells remains an attractive goal of molecular medicine. Lactaptin, a proteolytic fragment of the human milk kappa-casein, has been previously identified as a protein displaying potent killing of cancer cells in vitro. Its recombinant analog (RL2) produced in E. coli has been shown to delay solid tumor growth in vivo. Given that lactaptin is of human origin and is not immunogenic, it can be administered to patients multiple times without running the risk of immune response that could dampen the therapy efficacy. In the present study, we demonstrate that the combination of RL2 and cyclophosphamide treatments has an additive therapeutic effect against hepatoma tumor in immunocompetent mice. We asked whether production of lactaptin in human rather than bacterial cells would result in a protein with increased cytotoxic activity. Using lentiviral vector pCDH as a backbone, two constructs, pEL1 and pEL2, encoding secreted forms of lactaptin that differ in their signal sequences were created. Lactaptin expression in human cell lines was confirmed using Western-blot analysis, whereas ELISA was used for quantification of secreted lactaptin. Next, we measured the cytotoxic effects of the media conditioned by pEL1-transfected HEK293T cells, as assayed against the panel of three human cancer cell lines: MDA-MB-231 (adenocarcinoma), PC3 (prostate cancer), and T98G (glioblastoma). We show that EL1-derived lactaptin is at least 100-fold more cytotoxic than RL2. Taken together, our results provide an opportunity for developing armored immune cells as an “off-the-shelf” platform for targeted delivery of lactaptin to cancer cells. 

лактаптинпроапоптотические белкипротивоопухолевая терапиялентивирусные конструкцииlactaptinproapoptotic proteinsantitumor therapylentiviral expression constructsReferencesBondarenko D.A., Richter V.A., Kuligina E.V., Koval O.A., Fomin A.S., Skoblov Y.S., Dyachenko I.A., Kravchenko I.N., Sadovnikova E.A., Semushina S.G., Novikova N.I., Turobov V.I., Murashev A.N. Toxicity studies and pharmacokinetics of Lactaptin. Biofarmatsevticheskiy zhurnal = Journal of Biopharmaceuticals. 2015;7(2):40­47. (in Russian)Bondarenko D.A., Richter V.A., Kuligina E.V., Koval O.A., Fomin A.S., Skoblov Y.S., Dyachenko I.A., Kravchenko I.N., Sadovnikova E.A., Semushina S.G., Novikova N.I., Turobov V.I., Murashev A.N. Toxicity studies and pharmacokinetics of Lactaptin. Biofarmatsevticheskiy zhurnal = Journal of Biopharmaceuticals. 2015;7(2):40­47. (in Russian)Kakarla S., Gottschalk S. CAR T cells for solid tumors: armed and ready to go? Cancer J. 2014; 20(2):151­155. DOI 10.1097/PPO.0000000000000032.Kakarla S., Gottschalk S. CAR T cells for solid tumors: armed and ready to go? Cancer J. 2014; 20(2):151­155. DOI 10.1097/PPO.0000000000000032.Kaledin V.I., Nikolin V.P., Galyamova M.R., Vasil’eva E.D., Baymak T.Y., Popova N.A. High apoptosis­inducing and antitumor activities of the products of biological but not chemical cyclophosphamide activation. Doklady RAN = Proceedings of the Russian Academy of Sciences. 2002;386(5):705­708. (in Russian)Kaledin V.I., Nikolin V.P., Galyamova M.R., Vasil’eva E.D., Baymak T.Y., Popova N.A. High apoptosis­inducing and antitumor activities of the products of biological but not chemical cyclophosphamide activation. Doklady RAN = Proceedings of the Russian Academy of Sciences. 2002;386(5):705­708. (in Russian)Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium phosphate transfection. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2003;9. DOI 10.1002/0471142727.mb0901s63.Kingston R.E., Chen C.A., Rose J.K. Calcium phosphate transfection. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2003;9. DOI 10.1002/0471142727.mb0901s63.Knappskog S., Ravneberg H., Gjerdrum C., Trösse C., Stern B., Pryme I.F. The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide. J. Biotechnol. 2007;128(4):705­715. DOI 10.1016/j.jbiotec.2006.11.026.Knappskog S., Ravneberg H., Gjerdrum C., Trösse C., Stern B., Pryme I.F. The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide. J. Biotechnol. 2007;128(4):705­715. DOI 10.1016/j.jbiotec.2006.11.026.Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V.I., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Nikolin V.P., Nikitenko E.V., Richter V.A. A novel proapoptotic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice mo dels. Biochimie. 2012;94(12):2467­2474. DOI 10.1016/j.biochi.2012.08.017.Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V.I., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Nikolin V.P., Nikitenko E.V., Richter V.A. A novel proapoptotic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice mo dels. Biochimie. 2012;94(12):2467­2474. DOI 10.1016/j.biochi.2012.08.017.Koval O., Sakaeva G., Fomin A., Nushtaeva A., Semenov D., Kuligina E., Gulyaeva L., Gerasimov A., Richter V. Sensitivity of endometrial cancer cells from primary human tumour samples to new potential anticancer peptide lactaptin. J. Cancer Res. Ther. 2015;11(2): 345­351. DOI 10.4103/0973­1482.157301.Koval O., Sakaeva G., Fomin A., Nushtaeva A., Semenov D., Kuligina E., Gulyaeva L., Gerasimov A., Richter V. Sensitivity of endometrial cancer cells from primary human tumour samples to new potential anticancer peptide lactaptin. J. Cancer Res. Ther. 2015;11(2): 345­351. DOI 10.4103/0973­1482.157301.Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Zavjalov E.L., Richter V.A. Lactaptin induces p53­independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS ONE. 2014;9(4):e93921. DOI 10.1371/journal.pone.0093921.Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V., Zavjalov E.L., Richter V.A. Lactaptin induces p53­independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS ONE. 2014;9(4):e93921. DOI 10.1371/journal.pone.0093921.Kulemzin S.V., Chikaev N.A., Volkova O.Y., Kuznetsova V.V., Taranin A.V., Gorchakov A.A. Modular lentiviral vector system for chimeric antigen receptor design optimization. Bioorganicheskaya khimiya = Journal of Bioorganic Chemistry. 2017b;43(2):124­132. DOI 10.7868/S0132342317020117. (in Russian)Kulemzin S.V., Chikaev N.A., Volkova O.Y., Kuznetsova V.V., Taranin A.V., Gorchakov A.A. Modular lentiviral vector system for chimeric antigen receptor design optimization. Bioorganicheskaya khimiya = Journal of Bioorganic Chemistry. 2017b;43(2):124­132. DOI 10.7868/S0132342317020117. (in Russian)Kulemzin S.V., Kuznetsova V.V., Mamonkin M., Taranin A.V., Gorchakov A.A. CAR Т­cell therapy: Balance of efficacy and safety. Molekulyarnaya biologiya = Molecular Biology (Moscow). 2017a; 51(2):274­287. DOI 10.7868/S0026898417020148. (in Russian)Kulemzin S.V., Kuznetsova V.V., Mamonkin M., Taranin A.V., Gorchakov A.A. CAR Т­cell therapy: Balance of efficacy and safety. Molekulyarnaya biologiya = Molecular Biology (Moscow). 2017a; 51(2):274­287. DOI 10.7868/S0026898417020148. (in Russian)Lo K.M., Sudo Y., Chen J., Li Y., Lan Y., Kong S.M., Chen L., An Q., Gillies S.D. High level expression and secretion of Fc­X fusion proteins in mammalian cells. Protein Eng. 1998;11(6):495­500. DOI 10.1093/protein/11.6.495.Lo K.M., Sudo Y., Chen J., Li Y., Lan Y., Kong S.M., Chen L., An Q., Gillies S.D. High level expression and secretion of Fc­X fusion proteins in mammalian cells. Protein Eng. 1998;11(6):495­500. DOI 10.1093/protein/11.6.495.Merino D., Lalaoui N., Morizot A., Solary E., Micheau O. TRAIL in cancer therapy: present and future challenges. Expert Opin. Ther. Targets. 2007;11(10):1299­1314. DOI 10.1517/14728222.11.10.1299.Merino D., Lalaoui N., Morizot A., Solary E., Micheau O. TRAIL in cancer therapy: present and future challenges. Expert Opin. Ther. Targets. 2007;11(10):1299­1314. DOI 10.1517/14728222.11.10.1299.Nagane M., Huang H.J., Cavenee W.K. The potential of TRAIL for cancer chemotherapy. Apoptosis. 2001;6(3):191­197. DOI 10.1023/A:1011336726649.Nagane M., Huang H.J., Cavenee W.K. The potential of TRAIL for cancer chemotherapy. Apoptosis. 2001;6(3):191­197. DOI 10.1023/A:1011336726649.Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogs of a novel milk pro­apoptotic peptide, lactaptin, and their effect on cultured human cells. Protein J. 2010;29(3):174­180. DOI 10.1007/s10930­010­9237­5.Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.N., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogs of a novel milk pro­apoptotic peptide, lactaptin, and their effect on cultured human cells. Protein J. 2010;29(3):174­180. DOI 10.1007/s10930­010­9237­5.Shagin D.A., Barsova E.V., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Labas Y.A., Semenova T.N., Ugalde J.A., Meyers A., Nunez J.M., Widder E.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. GFP­like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol. Biol. Evol. 2004;21(5):841850. DOI 10.1093/molbev/msh079.Shagin D.A., Barsova E.V., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Labas Y.A., Semenova T.N., Ugalde J.A., Meyers A., Nunez J.M., Widder E.A., Lukyanov S.A., Matz M.V. GFP­like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functional features and structural complexity. Mol. Biol. Evol. 2004;21(5):841850. DOI 10.1093/molbev/msh079.Song X., Hong S.H., Kwon W.T., Bailey L.M., Basse P., Bartlett D.L., Kwon Y.T., Lee Y.J. Secretory TRAIL­armed natural killer cellbased therapy: in vitro and in vivo colorectal peritoneal carcinomatosis xenograft. Mol. Cancer Ther. 2016;15(7):1591­1601. DOI 10.1158/1535­7163.MCT­15­0937.Song X., Hong S.H., Kwon W.T., Bailey L.M., Basse P., Bartlett D.L., Kwon Y.T., Lee Y.J. Secretory TRAIL­armed natural killer cellbased therapy: in vitro and in vivo colorectal peritoneal carcinomatosis xenograft. Mol. Cancer Ther. 2016;15(7):1591­1601. DOI 10.1158/1535­7163.MCT­15­0937.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.