vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/VJ18.31-ovavilov-1717Research ArticleАКТУАЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИMAINSTREAM TECHNOLOGIES IN CELL BIOLOGYОценка эффективности эрадикации стволовых инициирующих раковых клеток на примере первичных культур глиобластомы человекаEvaluation of a strategy for tumor-initiating stem cell eradication in primary human glioblastoma cultures as a modelhttps://orcid.org/0000-0002-5543-248XДолговаЕ. В.DolgovaE. V.

Новосибирск

Novosibirsk

dolgova.ev@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7650-4331ПроскуринаА. С.ProskurinaA. S.

Новосибирск

Novosibirsk

ПоттерЕ. А.PotterE. A.

Новосибирск

Novosibirsk

https://orcid.org/0000-0002-7987-2017ТыриноваТ. В.TyrinovaT. V.

Новосибирск

Novosibirsk

ТарановО. С.TaranovO. S.

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Koltsovo, Novosibirsk region

https://orcid.org/0000-0002-0649-7543ЕфремовЯ. Р.EfremovYa. R.

Novosibirsk

https://orcid.org/0000-0001-9718-9038ОрищенкоК. Е.OrishchenkoK. E.

Новосибирск

Novosibirsk

МишиновС. В.MishinovS. V.СтупакВ. В.StupakV. V.https://orcid.org/0000-0001-6895-938XОстанинА. А.OstaninA. A.

Новосибирск

Novosibirsk

https://orcid.org/0000-0003-2346-6279ЧерныхЕ. Р.ChernykhE. R.

Новосибирск

Novosibirsk

https://orcid.org/0000-0002-2019-9382БогачевС. С.BogachevS. S.

Новосибирск

Novosibirsk

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наукРоссияInstitute of Cytology and Genetics SB RASRussian FederationНаучно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологииРоссияInstitute of Fundamental and Clinical ImmunologyRussian FederationГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»РоссияThe State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector"Russian FederationФедеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университетРоссияInstitute of Cytology and Genetics SB RAS; Novosibirsk State UniversityRussian FederationНовосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFirst Department of Neurosurgery, Y.L. Tsivian Novosibirsk Research Institute of Traumatology and OrthopaedicsRussian Federation201808112018227825836Copyright © Долгова Е.В., Проскурина А.С., Поттер Е.А., Тыринова Т.В., Таранов О.С., Ефремов Я.Р., Орищенко К.Е., Мишинов С.В., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р., Богачев С.С., 20182018Долгова Е.В., Проскурина А.С., Поттер Е.А., Тыринова Т.В., Таранов О.С., Ефремов Я.Р., Орищенко К.Е., Мишинов С.В., Ступак В.В., Останин А.А., Черных Е.Р., Богачев С.С.Dolgova E.V., Proskurina A.S., Potter E.A., Tyrinova T.V., Taranov O.S., Efremov Y.R., Orishchenko K.E., Mishinov S.V., Stupak V.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/1717

.

Из фрагмента ткани опухоли, взятого во время хирургической операции у больных К. (жен., 61 г., диагноз: рецидив глиобластомы) и Ж. (жен., 60 лет, диагноз: рецидив глиобластомы), были получены первичные культуры клеток глиобластомы  человека. На  основе новой стратегии синхронизации стволовых инициирующих раковых клеток и при использовании разработанного режима их эрадикации «3+1» была оценена эффективность нового терапевтического подхода, направленного на разрушение ракового клеточного сообщества, на первичных клеточных линиях глиобластомы человека. Ключевыми элемен тами стратегии служили следующие индикаторные результаты: 1)  оценка присутствия в  анализируемых культурах стволовых инициирующих раковых клеток по их способности поглощать  двуцепочечную ДНК, меченную красителем (TAMRA+ клетки); 2) определение реперных временных точек цикла  репарации  межцепочечных сшивок дНК, индуцированных кросс- линкирующим цитостатиком митомицином С; 3) оценка синхронизации клеток в фазах клеточного цикла; 4) определение дня после начала терапии, на который TAMRA+ клетки синхронно присутствуют в G1/S-фазе клеточного цикла, чувствительной для обработок; 5) определение режима эрадикации TAMRA+ клеток (стволовых инициирующих раковых клеток). Обработка культур проводилась кросслинкирующим цитостатиком митомицином С и сложнокомпозиционным препаратом дНК. Показано, что после проведенных обработок клетки перестают делиться и культуры деградируют. Клеточная линия К. к 30-м суткам наблюдения полностью деградировала. Количество клеток культуры Ж. к 15-м суткам наблюдения упало от исходного практически в три раза. Этот показатель по отношению к контролю на 15-й день измерения составил 1/7.45 для митомицина С и 1/10.28 для митомицина С и ДНК. Основное действие комбинация препаратов митомицин С и ДНК оказывает на TAMRA+ стволовые инициирующие раковые клетки клеточных популя ций глиобластом. Использование митомицина С как в изо лированном виде, так и в комбинации с ДНК демонстрирует эффективное элиминирующее действие как на TAMRA+ стволовые инициирующие клетки, так и на первичные культуры глиобластом человека в целом.

Primary cultures of human glioblastoma were obtained from the surgical material of patients K. (female, 61 years, Ds: relapse of glioblastoma) and Zh. (female, 60 years, Ds: relapse of glioblastoma). The effectiveness of a new therapeutic approach aimed at destroying the cancer cell community was evaluated on the primary cell lines of human glioblastoma culture by employing a new strategy of tumor-initiating stem cell synchronization and a domestic strategy of their eradication "3+1". The key elements of the strategy were the following indicator results: (1) evaluation of the presence of tumor-initiating stem cells in a population of cells from analyzed cultures by their ability to internalize double-stranded labeled DNA (TAMRA+ cells); (2) determination of the reference time points of the repair cycle of DNA interstrand cross-links induced by cross-linking cytostatic mitomycin C; (3) evaluation of cell cycle synchronization; (4) determination of the time (day after therapy initiation) when TAMRA+ cells were synchronously present in phase G1/S of the cell cycle, sensitive to the therapy; and (5) establishment of the TAMRA+ (tumor-initiating stem cells) eradication schedule. The cultures were treated with cross-linking cytostatic mitomycin C and a compositional DNA preparation. After the treatments, cell division slows down, and the cultures degrade. The K cell line completely degraded within 30 days of observation. The cell number of the Zh culture fell to nearly one-third of the starting value by day 15 of observation. On day 15, this indicator constituted 1/7.45 for mitomycin C and 1/10.28 for mitomycin C + DNA with reference to the control. The main target of the mitomycin C + DNA regimen was TAMRA+ tumor-initiating stem cells of the glioblastoma cell populations. The action of mitomycin C alone or in the combination with DNA demonstrated effective elimination of TAMRA+ tumor-initiating stem cells and the whole primary cultures of human glioblastomas.

глиобластомапервичная культурамитомицин Сстволовые инициирующие раковые клеткиTAMRA-флуорохромglioblastomaprimary cell linemytomycin Ctumor-initiating stem cellsTAMRA-fluorochromState Budgeted Project 0324-2018-0019 and the Russian Foundation for Basic Research, project 15-04-03386ReferencesНикифорова З.Н., Кудрявцев И.А., Арноцкая Н.Е., Брюховецкий И.С., Шевченко В.Е. Опухолевые стволовые клетки мультиформной глиобластомы. Усп. молекуляр. онкологии. 2016;3:26-33. DOI 10.17650/2313-805X-2016-3-2-26-33.Nikiforova Z.N., Kudryavtsev I.A., Arnotskaya N.E., Bryukhovetskiy I.S., Shevchenko V.E. Tumor stem cells from glioblastoma multiforme. Uspekhi Molekulyarnoy Onkologii = Advances in Molecular Oncology. 2016; 3:26-33. DOI 10.17650/2313-805X-2016-3-2-26-33. (in Russian)Поттер Е.А., Долгова Е.В., Проскурина А.С., Ефремов Я.Р., Таранов О.С., Николин В.П., Попова Н.А., Дубатолова Т.Д., Петрова Д.Д., Верещагин Е.И., Минкевич А.М., Андрушкевич О.М., Байбородин С.И., Рогачев В.А., Останин А.А., Черных Е.Р., Колчанов Н.А., Богачев С.С. Разработка регламента терапевтического режима, основанного на синергичном действии ци-клофосфана и препаратов двуцепочечной ДНК, приводящего к полному вылечиванию экспериментальных животных от асцитной формы опухоли мыши Кребс-2. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016;20(5):723-735.Potter Е.А., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Efremov Ya.R., Taranov O.S., Nikolin V.P., Popova N.A., Dubatolova T.D., Petrova D.D., Vereschagin E.I., Minke-vich А.М., Andrushkevich O.M., Baiborodin S.I., Rogachev V.A., Ostanin А.А., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. Development of the therapeutic regimen based on the synergistic activity of cyclophosphamide and double-stranded DNA preparation which results in complete cure of mice engrafted with Krebs-2 ascites. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2016;20(5):723-735. DOI 10.18699/VJ16.162. (in Russian)Alyamkina E.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Minkevich A.M., Ko-zel A.V., Dolgova E.V., Efremov Y.R., Bayborodin S.I., Andrushkevich O.M., Taranov O.S., Omigov V.V., Rogachev V.A., Proskurina A.S., Vereschagin E.I., Kiseleva E.V., Zhukova M.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Combination of cyclophosphamide and double-stranded DNA demonstrates synergistic toxicity against established xenografts. Cancer Cell Int. 2015;15:32. DOI 10.1186/s12935-015-0180-6.Alyamkina E.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Minkevich A.M., Ko-zel A.V., Dolgova E.V., Efremov Y.R., Bayborodin S.I., Andrushkevich O.M., Taranov O.S., Omigov V.V., Rogachev V.A., Proskurina A.S., Vereschagin E.I., Kiseleva E.V., Zhukova M.V., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Combination of cyclophosphamide and double-stranded DNA demonstrates synergistic toxicity against established xenografts. Cancer Cell Int. 2015;15:32. DOI 10.1186/s12935-015-0180-6.Bao S., Wu Q., McLendon R.E., Hao Y., Shi Q., Hjelmeland A.B., De-whirst M.W., Bigner D.D., Rich J.N. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444(7120):756-760. DOI 10.1038/nature05236.Bao S., Wu Q., McLendon R.E., Hao Y., Shi Q., Hjelmeland A.B., De-whirst M.W., Bigner D.D., Rich J.N. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 2006;444(7120):756-760. DOI 10.1038/nature05236.Beier D., Hau P., Proescholdt M., Lohmeier A., Wischhusen J., Oef-ner P.J., Aigner L., Brawanski A., Bogdahn U., Beier C.P. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 2007;67(9):4010-4015. DOI 10.1158/0008-5472.CAN-06-4180.Beier D., Hau P., Proescholdt M., Lohmeier A., Wischhusen J., Oef-ner P.J., Aigner L., Brawanski A., Bogdahn U., Beier C.P. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 2007;67(9):4010-4015. DOI 10.1158/0008-5472.CAN-06-4180.Brescia P., Richichi C., Pelicci G. Current strategies for identification of glioma stem cells: adequate or unsatisfactory? J. Oncol. 2012;2012: 376894. DOI 10.1155/2012/376894.Brescia P., Richichi C., Pelicci G. Current strategies for identification of glioma stem cells: adequate or unsatisfactory? J. Oncol. 2012;2012: 376894. DOI 10.1155/2012/376894.Carruthers R., Ahmed S.U., Strathdee K., Gomez-Roman N., Amoah-Buahin E., Watts C., Chalmers A.J. Abrogation of radioresistance in glioblastoma stem-like cells by inhibition of ATM kinase. Mol. Oncol. 2015;9(1):192-203. DOI 10.1016/j.molonc.2014.08.003.Carruthers R., Ahmed S.U., Strathdee K., Gomez-Roman N., Amoah-Buahin E., Watts C., Chalmers A.J. Abrogation of radioresistance in glioblastoma stem-like cells by inhibition of ATM kinase. Mol. Oncol. 2015;9(1):192-203. DOI 10.1016/j.molonc.2014.08.003.Chen R., Nishimura M.C., Bumbaca S.M., Kharbanda S., Forrest W.F., Kasman I.M., Greve J.M., Soriano R.H., Gilmour L.L., Rivers C.S., Modrusan Z., Nacu S., Guerrero S., Edgar K.A., Wallin J.J., Lam-szus K., Westphal M., Heim S., James C.D., VandenBerg S.R., Costello J.F., Moorefield S., Cowdrey C.J., Prados M., Phillips H.S. A hierarchy of self-renewing tumor-initiating cell types in glioblastoma. Cancer Cell. 2010;17(4):362-375. DOI 10.1016/j.ccr.2009.12.049.Chen R., Nishimura M.C., Bumbaca S.M., Kharbanda S., Forrest W.F., Kasman I.M., Greve J.M., Soriano R.H., Gilmour L.L., Rivers C.S., Modrusan Z., Nacu S., Guerrero S., Edgar K.A., Wallin J.J., Lam-szus K., Westphal M., Heim S., James C.D., VandenBerg S.R., Costello J.F., Moorefield S., Cowdrey C.J., Prados M., Phillips H.S. A hierarchy of self-renewing tumor-initiating cell types in glioblastoma. Cancer Cell. 2010;17(4):362-375. DOI 10.1016/j.ccr.2009.12.049.Dahlrot R.H., Hansen S., Jensen S.S., Schrader H.D., Hjelmborg J., Kristensen B.W. Clinical value of CD133 and nestin in patients with glioma: a population-based study. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2014; 7(7):3739-3751.Dahlrot R.H., Hansen S., Jensen S.S., Schrader H.D., Hjelmborg J., Kristensen B.W. Clinical value of CD133 and nestin in patients with glioma: a population-based study. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2014; 7(7):3739-3751.Dolgova E.V., Alyamkina E.A., Efremov Y.R., Nikolin V.P., Popova N.A., Tyrinova T.V., Kozel A.V., Minkevich A.M., Andrushkevich O.M., Zavyalov E.L., Romaschenko A.V., Bayborodin S.I., Taranov O.S., Omigov V.V., Shevela E.Y., Stupak V.V., Mishi-nov S.V., Rogachev V.A., Proskurina A.S., Mayorov V.I., Shurdov M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Identification of cancer stem cells and a strategy for their elimination. Cancer Biol. Ther. 2014;15(10):1378-1394. DOI 10.4161/cbt.29854.Dolgova E.V., Alyamkina E.A., Efremov Y.R., Nikolin V.P., Popova N.A., Tyrinova T.V., Kozel A.V., Minkevich A.M., Andrushkevich O.M., Zavyalov E.L., Romaschenko A.V., Bayborodin S.I., Taranov O.S., Omigov V.V., Shevela E.Y., Stupak V.V., Mishi-nov S.V., Rogachev V.A., Proskurina A.S., Mayorov V.I., Shurdov M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Identification of cancer stem cells and a strategy for their elimination. Cancer Biol. Ther. 2014;15(10):1378-1394. DOI 10.4161/cbt.29854.Dolgova E.V., Mishinov S.V., Proskurina A.S., Potter E.A., Efremov Y.R., Bayborodin S.I., Tyrinova T.V., Stupak V.V., Ostatin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Novel cancer stem marker and its applicability for grading primary human gliomas. Technol. Cancer Res. Treat. 2018;17:1533034617753812. DOI 10.1177/1533034617753812.Dolgova E.V., Mishinov S.V., Proskurina A.S., Potter E.A., Efremov Y.R., Bayborodin S.I., Tyrinova T.V., Stupak V.V., Ostatin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Novel cancer stem marker and its applicability for grading primary human gliomas. Technol. Cancer Res. Treat. 2018;17:1533034617753812. DOI 10.1177/1533034617753812.Gilbert C.A., Ross A.H. Glioma stem cells: cell culture, markers and targets for new combination therapies. Cancer Stem Cells Theories Practice. 2011. DOI 10.5772/13626.Gilbert C.A., Ross A.H. Glioma stem cells: cell culture, markers and targets for new combination therapies. Cancer Stem Cells Theories Practice. 2011. DOI 10.5772/13626.Kase M., Minajeva A., Niinepuu K., Kase S., Vardja M., Asser T., Jaal J. Impact of CD133 positive stem cell proportion on survival in patients with glioblastoma multiforme. Radiol. Oncol. 2013;47(4):405-410. DOI 10.2478/raon-2013-0055.Kase M., Minajeva A., Niinepuu K., Kase S., Vardja M., Asser T., Jaal J. Impact of CD133 positive stem cell proportion on survival in patients with glioblastoma multiforme. Radiol. Oncol. 2013;47(4):405-410. DOI 10.2478/raon-2013-0055.McNeill K.A. Epidemiology of brain tumors. Neurol. Clin. 2016; 34(4):981-998. DOI 10.1016/j.ncl.2016.06.014.McNeill K.A. Epidemiology of brain tumors. Neurol. Clin. 2016; 34(4):981-998. DOI 10.1016/j.ncl.2016.06.014.Niedernhofer L.J., Odijk H., Budzowska M., Drunen E., Maas A., Theil A.F., Wit J., Jaspers N.G.J., Beverloo H.B., Hoeijmakers J.H.J., Kanaar R. The structure-specific endonuclease Ercc1-Xpf is required to resolve DNA interstrand cross-link-induced double-strand breaks. Mol. Cell Biol. 2004;24(13):5776-5787.Niedernhofer L.J., Odijk H., Budzowska M., Drunen E., Maas A., Theil A.F., Wit J., Jaspers N.G.J., Beverloo H.B., Hoeijmakers J.H.J., Kanaar R. The structure-specific endonuclease Ercc1-Xpf is required to resolve DNA interstrand cross-link-induced double-strand breaks. Mol. Cell Biol. 2004;24(13):5776-5787.O’Brien C.A., Kreso A., Jamieson C.H.M. Cancer stem cells and selfrenewal. Clin. Cancer Res. 2010;16(12):3113-3120. DOI 10.1158/1078-0432.CCR-09-2824.O’Brien C.A., Kreso A., Jamieson C.H.M. Cancer stem cells and selfrenewal. Clin. Cancer Res. 2010;16(12):3113-3120. DOI 10.1158/1078-0432.CCR-09-2824.Omuro A., DeAngelis L.M. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA. 2013;310(17):1842-1850. DOI 10.1001/jama.2013.280319.Omuro A., DeAngelis L.M. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review. JAMA. 2013;310(17):1842-1850. DOI 10.1001/jama.2013.280319.Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Efremov Y.R., Minkevich A.M., Rozanov A.S., Peltek S.E., Nikolin V.P., Popova N.A., Seledtsov I.A., Molodtsov V.V., Zavyalov E.L., Taranov O.S., Baiborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. Gene expression profiling of tumor-initiating stem cells from mouse Krebs-2 carcinoma using a novel marker of poorly differentiated cells. Oncotarget. 2017;8(6):9425-9441. DOI 10.18632/oncotarget.14116.Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Efremov Y.R., Minkevich A.M., Rozanov A.S., Peltek S.E., Nikolin V.P., Popova N.A., Seledtsov I.A., Molodtsov V.V., Zavyalov E.L., Taranov O.S., Baiborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. Gene expression profiling of tumor-initiating stem cells from mouse Krebs-2 carcinoma using a novel marker of poorly differentiated cells. Oncotarget. 2017;8(6):9425-9441. DOI 10.18632/oncotarget.14116.Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Minkevich A.M., Efremov Y.R., Taranov O.S., Omigov V.V., Nikolin V.P., Popova N.A, Bayborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Shurdov M.A., Bogachev S.S. A strategy to eradicate well-developed Krebs-2 ascites in mice. Oncotarget. 2016;7(10):11580-11594. DOI 10.18632/oncotarget.7311.Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Minkevich A.M., Efremov Y.R., Taranov O.S., Omigov V.V., Nikolin V.P., Popova N.A, Bayborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Shurdov M.A., Bogachev S.S. A strategy to eradicate well-developed Krebs-2 ascites in mice. Oncotarget. 2016;7(10):11580-11594. DOI 10.18632/oncotarget.7311.Qiang L., Yang Y., Ma Y., Chen F., Zhang L., Liu W., Qi Q., Lu N., Tao L., Wang X., You Q., Guo Q. Isolation and characterization of cancer stem like cells in human glioblastoma cell lines. Cancer Lett. 2009;279:13-21. DOI 10.1016/j.canlet.2009.01.016.Qiang L., Yang Y., Ma Y., Chen F., Zhang L., Liu W., Qi Q., Lu N., Tao L., Wang X., You Q., Guo Q. Isolation and characterization of cancer stem like cells in human glioblastoma cell lines. Cancer Lett. 2009;279:13-21. DOI 10.1016/j.canlet.2009.01.016.Schreck K.C., Taylor P., Marchionni L., Gopalakrishnan V, Bar E.E., Gaiano N., Eberhart C.G. The notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin. Cancer Res. 2010;16(24):6060-6070. DOI 10.1158/1078-0432.CCR-10-1624.Schreck K.C., Taylor P., Marchionni L., Gopalakrishnan V, Bar E.E., Gaiano N., Eberhart C.G. The notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin. Cancer Res. 2010;16(24):6060-6070. DOI 10.1158/1078-0432.CCR-10-1624.Takezaki T., Hide T., Takanaga H., Nakamura H., Kuratsu J., Kon-do T. Essential role of the Hedgehog signaling pathway in human glioma-initiating cells. Cancer Sci. 2011;102(7):1306-1312. DOI 10.1111/j.1349-7006.2011.01943.x.Takezaki T., Hide T., Takanaga H., Nakamura H., Kuratsu J., Kon-do T. Essential role of the Hedgehog signaling pathway in human glioma-initiating cells. Cancer Sci. 2011;102(7):1306-1312. DOI 10.1111/j.1349-7006.2011.01943.x.Wang Y., Xu C., Du L.Q., Cao J., Liu J.X., Su X., Zhao H., Fan F., Wang B., Katsube T., Fan S.J., Liu Q. Evaluation of the comet assay for assessing the dose-response relationship of DNA damage induced by ionizing radiation. Int. J. Mol. Sci. 2013;14(11):22449-22461. DOI 10.3390/ijms141122449.Wang Y., Xu C., Du L.Q., Cao J., Liu J.X., Su X., Zhao H., Fan F., Wang B., Katsube T., Fan S.J., Liu Q. Evaluation of the comet assay for assessing the dose-response relationship of DNA damage induced by ionizing radiation. Int. J. Mol. Sci. 2013;14(11):22449-22461. DOI 10.3390/ijms141122449.Zhang M., Song T., Yang L., Chen R., Wu L., Yang Z., Fang J. Nes-tin and CD133: valuable stem cell-specific markers for determining clinical outcome of glioma patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2008; 27:85. DOI 10.1186/1756-9966-27-85.Zhang M., Song T., Yang L., Chen R., Wu L., Yang Z., Fang J. Nes-tin and CD133: valuable stem cell-specific markers for determining clinical outcome of glioma patients. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2008; 27:85. DOI 10.1186/1756-9966-27-85.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.