Модификация геномов культурных растений при помощи компонентов бактериальной защитной системы CRISPR/Cas в настоящее время является быстроразвивающейся областью прикладной науки. Методика индукции сайт-специфических изменений в растительных геномах, как правило, включает такие этапы, как конструирование генетических векторов, содержащих гены нуклеазы Cas9 и химерной направляющей РНК, доставку плазмидной ДНК или рибонуклеопротеиновых частиц в клетки растений, что приводит к внесению изменений в выбранный сайт геномной ДНК, и последующую регенерацию растений из модифицированных клеток. Применение этой технологии в селекции ограничено тем, что генотипы в разной степени подвержены генетической трансформации и различаются по способности к регенерации in vitro. Генотип-зависимость эффективности биотехнологических манипуляций особенно ярко выражена у культурных зерновых злаков. В настоящей работе была проведена оценка эффективности регенерации растений in vitro из клеток незрелых зародышей десяти сибирских сортов ячменя. Было показано, что только один из исследуемых сортов сопоставим с модельным для биотехнологических и генно-инженерных работ сортом Golden Promise. Сорт Алей продемонстрировал самую высокую эффективность регенерации среди сибирских сортов ячменя и был выбран для проведения эксперимента по модификации генома в протопластах мезофилла листа. Для проведения модификации генома было выбрано два целевых гена, которые контролируют хозяйственные признаки. Ген Nud контролирует признак голозерности или пленчатости, ген Vrs1 – признак двурядности или шестирядности. Были сконструированы генетические век торы, несущие систему модификации генома, направленную на три сайта в двух целевых генах. Конструкции были введены в протопласты методом полиэтиленгликоль-зависимой трансформации, детекция мутаций осуществлялась методом глубокого секвенирования целевых последовательностей, амплифицированных с геномной ДНК трансформированной клеточной популяции. Мутации были выявлены в 6–20 % популяции трансформированных клеток. Делеции разного размера обнаружены в трех целевых сайтах, однонуклеотидные инсерции обнаружены только в одном из сайтов. Результаты, полученные в работе, демонстрируют возможность сайт-специфической модификации генома сибирского ячменя. Дальнейшие шаги по развитию технологии сайт-направленной модификации геномов культурных злаков потребуют разработки «генотип-независимых» методов генетической трансформации клеток и последующей регенерации растений из модифицированных клеток.
The modifcation of crop genomes employing functional components of the microbial CRISPR/Cas immune system is a rapidly developing area of applied research. Site-directed plant genome modifcation by this technology involves the construction of Cas endonuclease- and guide-RNA-encoding vectors, delivery of the plasmid DNA into plant cells, processing of the chosen genomic target site by the corresponding gene products and regeneration of plants from modifed cells. The utilization of this technology in local breeding programs is mainly limited by the typically strong genotype dependence of gene transfer and in vitro regeneration procedures, which holds particularly true in cereals. In the present study, an evaluation of in vitro regeneration efciency of immature embryos of ten Siberian barley cultivars revealed that only one of these is on a par with the experimental standard cultivar Golden Promise. This cultivar, namely cv. Aley, was consequently chosen for further experiments on site-directed mutagenesis in leaf mesophyll protoplasts. Two genes controlling hulled vs naked (Nud) and two-rowed vs six-rowed barley (Vrs1) were used as targets to be modifed via polyethyleneglycol-mediated cellular uptake of guide-RNA/Cas9-encoding plasmid DNA. Deep-sequencing of amplicons obtained from protoplast genomic DNA revealed that 6 to 22 percent of the target sites were mutated. The detected modifcations comprised deletions in all three target sites and of various sizes, whereas insertions were observed in only one of the target genes (Vrs1) and were confned to the size of 1 nucleotide. This study demonstrates the possibility of site-directed genome modifcation in Siberian barley. Further steps in technology advancement will require the development of protocols with reduced genotype dependence in terms of both the gene transfer to totipotent cells and the subsequent plant regeneration originating from such cells.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.