vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/VJ20.616vavilov-2588Research ArticleМОЛЕКУЛЯРНАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯMOLECULAR AND CELL BIOLOGYРекомбинантный укороченный белок TNF-BD вируса натуральной оспы проявляет специфическую фармакологическую активность в экспериментальной модели септического шокаRecombinant short TNF-BD protein from smallpox virus is pharmacologically active in an experimental septic shock modelhttps://orcid.org/0000-0002-3309-7107ГилеваИ. П.GilevaI. P.

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Koltsovo, Novosibirsk region

https://orcid.org/0000-0002-0496-390XЯкубицкийС. Н.YakubitskiyS. N.

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Koltsovo, Novosibirsk region

https://orcid.org/0000-0003-2317-4153КолосоваИ. В.KolosovaI. V.

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Koltsovo, Novosibirsk region

https://orcid.org/0000-0002-6255-9745ЩелкуновС. Н.ShchelkunovS. N.

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Koltsovo, Novosibirsk region

snshchel@vector.nsc.ruГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» РоспотребнадзораРоссияState Research Center of Virology and Biotechnology “Vector'’, RospotrebnadzorRussian FederationГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики, Сибирское отделение Российской академии наукРоссияState Research Center of Virology and Biotechnology “Vector'’, Rospotrebnadzor; Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesRussian Federation202028052020243239243Copyright © Гилева И.П., Якубицкий С.Н., Колосова И.В., Щелкунов С.Н., 20202020Гилева И.П., Якубицкий С.Н., Колосова И.В., Щелкунов С.Н.Gileva I.P., Yakubitskiy S.N., Kolosova I.V., Shchelkunov S.N.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/2588

Фактор некроза опухолей (TNF) - один из основных цитокинов, медиаторов иммунной системы, обеспечивающих защиту организма человека от вирусных инфекций. В процессе эволюции антропогенный вирус натуральной оспы (Variola virus, VARV) освоил эффективные механизмы преодоления иммунологических барьеров человека, кодируя в своем геноме белки, способные взаимодействовать с рецепторами цитокинов организма-хозяина, блокируя таким образом их активность. В частности, ген G2R этого вируса кодирует белок CrmB, который эффективно связывает TNF человека и мышей. При этом данный белок является двухдоменным и наряду с TNF-связывающим N-концевым доменом содержит С-концевой хемокин-связывающий домен. При использовании методологии молекулярного клонирования нами ранее получен рекомбинантный бакулови-рус, продуцирующий в клетках насекомых рекомбинантный белок CrmB вируса натуральной оспы (VARV-CrmB), и показан его TNF-нейтрализующий потенциал в различных тестах in vitro и in vivo. С целью снижения иммуногенности этого вирусного белка при его многократном введении для терапии хронических воспалительных заболеваний получена рекомбинантная плазмида, направляющая в клетках Escherichia coli биосинтез укороченного однодоменного TNF-связывающего (TNF-BD) белка VARV. Методом металл-хелатной аффинной хроматографии из клеток выделен рекомбинантный белок TNF-BD. Терапевтический потенциал белка TNF-BD изучен в экспериментальной модели септического шока, индуцированного в организме мышей введением бактериального липополисахарида (ЛПС). После индукции септического шока животным вводили разные дозы рекомбинантного белка TNF-BD и регистрировали их гибель в течение 7 сут. Все мыши, не получавшие препарат белка TNF-BD после инъекции ЛПС, погибли через 3 сут, а в группах животных, которым вводили TNF-BD, в зависимости от дозы этого белка выжили 30, 40 или 60 % мышей. Результаты исследования демонстрируют наличие специфической фармакологической активности у рекомбинантного белка TNF-BD, синтезированного в бактериальных клетках, в мышиной модели ЛПС-индуцированного септического шока.

Tumor necrosis factor (TNF) is one among the key cytokines that mediate the immune system to protect humans against viral infections. Throughout evolution, anthropogenic Variola virus (VARV) has developed effective mechanisms to overcome human defense reactions. The viral genome encodes soluble proteins imitating the structure of cellular cytokine receptors. These proteins compete with cellular receptors for cytokine binding, thus blocking the antiviral immune response. In particular, the G2R gene of VARV encodes the TNF decoy receptor, VARV-CrmB protein. This protein consists of N-ended TNF-biding (TNF-BD) and C-ended chemokine binding (Ch-BD) domains. Recombinant VARV-CrmB protein has been produced in insect cells using molecular cloning methods and its TNF neutralizing activity has been shown in vitro and in vivo. To decrease the immunogenicity of this protein, a recombinant plasmid coding for shortened TNF-BD protein of VARV in Escherichia coli cells has been constructed. Using the method of immobilized metal affinity chromatography, recombinant TNF-BD protein corresponding to the TNF-biding domain of VARV-CrmB protein was purified from E. coli cells. The therapeutic potential of TNF-BD was studied using an experimental model of LPS-induced septic shock. After septic shock induction, several doses of recombinant TNF-BD were injected and the mortality of experimental animals was observed during 7 days. All mice not injected with TNF-BD had been dead by day 3 of the experiment, but 30, 40 and 60 % of the experimental animals, who received different TNF-BD doses, survived in a dose-dependent manner. Data obtained demonstrate that recombinant TNF-BD protein is pharmacologically active in the experimental model of LPS-induced septic shock.

белок VARV-CrmBвирус натуральной оспыЛПСсептический шокTNF-связывающий доменVARV-CrmB proteinvariola virusLPSseptic shockTNF-biding domainThis work was supported by State Budgeted Project 0324-2019-0041 for ICG and the Russian Foundation for Basic Research, project 18-04-00022A. The authors are grateful to T.B. Tregubchak for providing plasmid pQE60-TNF-BDReferencesНепомнящих Т.С., Трегубчак Т.В., Якубицкий С.Н., Таранов О.С., Максютов Р.А., Щелкунов С.Н. Кандидатные антиревматические плазмидные конструкции обладают низкой иммуноген-ностью. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(3): 317-322. DOI 10.18699/VJ17.249.Nepomnyashchikh T.S., Tregubchak T.V., Yakubitskiy S.N., Tara-nov ОЯ., Maksyutov R.A., Shchelkunov S.N. Candidate antirheumatic genotherapeutic plasmid constructions have low immunoge-nicity. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2017;21(3):317-322. DOI 10.18699/VJ17.249. (in Russian)Трегубчак Т.В., Шеховцов С.В., Непомнящих Т.С., Пельтек С.Е., Колчанов Н.А., Щелкунов С.Н. TNF-связывающий домен белка VARV-CrmB, синтезированный в клетках Escherichia coli, эффективно взаимодействует с TNF человека. Докл. Акад. наук. 2015;462(4):488-492. DOI 10.7868/S0869565215160276.Tregubchak T.V., Shekhovtsov S.V., Nepomnyashchikh T.S., Pel-tek S.E., Kolchanov N.A., Shchelkunov S.N. TNF-binding domain of the variola virus CrmB protein synthesized in Escherichia coli cells effectively interacts with human TNF. Dokl. Biochem. Bio-phys. 2015;462(1):176-180. DOI 10.1134/S1607672915030102.Цырендоржиев Д.Д., Орловская И.А., Сенников С.В., Трегубчак Т.В., Гилева И.П., Цырендоржиева М.Д., Щелкунов С.Н. Биологические эффекты индивидуально синтезированного TNF-связывающего домена CrmB вируса натуральной оспы. Бюл. эксп. биол. мед. 2014;157(2):214-217.Tsyrendorzhiev D.D., Orlovskaya I.A., Sennikov S.V., Tregubchak T.V., Gileva I.P., Tsyrendorzhieva M.D., Shchelkunov S.N. Biological effects of individually synthesized TNF-binding domain of variola virus CrmB protein. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014;157(2):249-252. DOI 10.1007/s10517-014-2537-6.Alejo A., Ruiz-Arguello M.B., Ho Y., Smith V.P., Saraiva M., Al-cami A. A chemokine-binding domain in the tumor necrosis factor receptor from variola (smallpox) virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103:5995-6000.Alejo A., Ruiz-Arguello M.B., Ho Y., Smith V.P., Saraiva M., Al-cami A. A chemokine-binding domain in the tumor necrosis factor receptor from variola (smallpox) virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103:5995-6000.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976;72:248-254.Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976;72:248-254.Chen D.Y., Chen Y.M., Tsai W.C., Tseng J.C., Chen Y.H., Hsieh C.W., Hung W.T., Lan J.L. Significant associations of antidrug antibody levels with serum drug trough levels and therapeutic response of adalimumab and etanercept treatment in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2015;74(3):e16. DOI 10.1136/annrheumdis-2013-203893.Chen D.Y., Chen Y.M., Tsai W.C., Tseng J.C., Chen Y.H., Hsieh C.W., Hung W.T., Lan J.L. Significant associations of antidrug antibody levels with serum drug trough levels and therapeutic response of adalimumab and etanercept treatment in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2015;74(3):e16. DOI 10.1136/annrheumdis-2013-203893.Efron P.A., Mohr A.M., Moore F.F., Moldawer L.L. The future of murine sepsis and trauma research models. J. Leukoc. Biol. 2015; 98(6):945-952. DOI 10.1189/jlb.5MR0315-127R.Efron P.A., Mohr A.M., Moore F.F., Moldawer L.L. The future of murine sepsis and trauma research models. J. Leukoc. Biol. 2015; 98(6):945-952. DOI 10.1189/jlb.5MR0315-127R.Eng G.P., Bendtzen K., Bliddal H., Stoltenberg M., Szkudlarek M., Fana V, Lindegaard H.M., Omerovic E., Hojgaard P., Jensen E.K., Bouchelouche P.N. Antibodies to infliximab and adalimumab in patients with rheumatoid arthritis in clinical remission: a cross-sectional study. Arthritis. 2015;784825. DOI 10.1155/2015/784825.Eng G.P., Bendtzen K., Bliddal H., Stoltenberg M., Szkudlarek M., Fana V, Lindegaard H.M., Omerovic E., Hojgaard P., Jensen E.K., Bouchelouche P.N. Antibodies to infliximab and adalimumab in patients with rheumatoid arthritis in clinical remission: a cross-sectional study. Arthritis. 2015;784825. DOI 10.1155/2015/784825.Fei Y., Wang W., Kwiecinski J., Josefsson E., Pullerits R., Jonsson I.-M., Magnusson M., Jin T. The combination of a tumor necrosis factor inhibitor and antibiotic alleviates staphylococcal arthritis and sepsis in mice. J. Infed Dis. 2011;204(3):348-357. DOI 10.1093/infdis/jir266.Fei Y., Wang W., Kwiecinski J., Josefsson E., Pullerits R., Jonsson I.-M., Magnusson M., Jin T. The combination of a tumor necrosis factor inhibitor and antibiotic alleviates staphylococcal arthritis and sepsis in mice. J. Infed Dis. 2011;204(3):348-357. DOI 10.1093/infdis/jir266.Gileva I.P., Nepomnyashikh T.S., Antonets D.V., Lebedev L.R., Koch-neva G.V., Grazhdantseva A.V., Shchelkunov S.N. Properties of the recombinant TNF binding proteins from variola, monkepox and cowpox viruses are different. Biochem. Biophphys. Acta. 2006; 1764:1710-1718.Gileva I.P., Nepomnyashikh T.S., Antonets D.V., Lebedev L.R., Koch-neva G.V., Grazhdantseva A.V., Shchelkunov S.N. Properties of the recombinant TNF binding proteins from variola, monkepox and cowpox viruses are different. Biochem. Biophphys. Acta. 2006; 1764:1710-1718.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4. Nature. 1970;227:680-685.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4. Nature. 1970;227:680-685.Lamping N., Detter R., Schroder N.W., Pfeil D., Hallatschek W., Burger R., Schumann R.R. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or sram-negative bacteria. J. Clin. Invest. 1998;101(10):2065-2071.Lamping N., Detter R., Schroder N.W., Pfeil D., Hallatschek W., Burger R., Schumann R.R. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or sram-negative bacteria. J. Clin. Invest. 1998;101(10):2065-2071.Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ule-vitch R.J. Therapeutic strategies to block LPS interactions with its receptor. Prog. Clin. Biol. Res. 1995;392:473-477.Leturcq D.J., Moriarty A.M., Talbott G., Winn R.K., Martin T.R., Ule-vitch R.J. Therapeutic strategies to block LPS interactions with its receptor. Prog. Clin. Biol. Res. 1995;392:473-477.Mandel M., Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 1970;53:159-162.Mandel M., Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 1970;53:159-162.Monaco C., Nanchahal J., Taylor P., Feldmann M. Anty-TNF therapy: past, present and future. Int. Immunol. 2015;27(1):55-62. DOI 10.1093/intimm/dxu107.Monaco C., Nanchahal J., Taylor P., Feldmann M. Anty-TNF therapy: past, present and future. Int. Immunol. 2015;27(1):55-62. DOI 10.1093/intimm/dxu107.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.Seymour C.W., Rosengart M.R. Septic shock: advances in diagnoses and treatment. JAMA. 2015;314(7):708-717. DOI 10.1001/jama.2015.7885.Seymour C.W., Rosengart M.R. Septic shock: advances in diagnoses and treatment. JAMA. 2015;314(7):708-717. DOI 10.1001/jama.2015.7885.Shchelkunova G.A., Shchelkunov S.N. Immunomodulating drugs based on poxviral proteins. BioDrugs. 2016;30(1):9-16. DOI 10.1007/s40259-016-0158-5.Shchelkunova G.A., Shchelkunov S.N. Immunomodulating drugs based on poxviral proteins. BioDrugs. 2016;30(1):9-16. DOI 10.1007/s40259-016-0158-5.Stortz J.A., Raymond S.L., Mira J.C., Moldawer L.L., Mohr A.M., Efron P.A. Murine models of sepsis and trauma: Can we bridge the gap? ILAR J. 2017;58(1):90-105. DOI 10.1093./ilar/ilx007.Stortz J.A., Raymond S.L., Mira J.C., Moldawer L.L., Mohr A.M., Efron P.A. Murine models of sepsis and trauma: Can we bridge the gap? ILAR J. 2017;58(1):90-105. DOI 10.1093./ilar/ilx007.Thayer A. Centocor stops sales, trails or flagship drug. Chem. Eng. News. 1993;71(4):6. DOI 10.1021/cen-v71n004.p006.Thayer A. Centocor stops sales, trails or flagship drug. Chem. Eng. News. 1993;71(4):6. DOI 10.1021/cen-v71n004.p006.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.