Оспа овец имеет широкий географический ареал и представляет угрозу овцеводству во всем мире, так как заболевание высококонтагиозное и сопровождается большими экономическими потерями. В настоящее время для профилактики этого заболевания применяются вакцины на основе живых аттенуированных штаммов вируса. Подобные вакцины эффективны, однако потенциально опасны из-за возможной реверсии вируса к патогенному состоянию, поэтому весьма актуально создание безопасных рекомбинантных субъединичных вакцин против оспы овец. Известно, что хлоропласты растений в силу своей полиплоидности могут нарабатывать чужеродные белки в больших количествах. Целью данного исследования было получение транспластомных растений табака Nicotiana tabacum, синтезирующих один из кандидатных вакцинных белков вируса оспы овец L1R. Для проведения генетической трансформации хлоропластов создана конструкция, обеспечивающая интеграцию делеционного варианта гена SPPV_56, кодирующего N-концевую гидрофильную часть оболочечного белка L1R, в межгенную область trnG/trnfM хлоропластного генома табака путем гомологичной рекомбинации. Методом биобаллистики с помощью «генной пушки» получены линии табака, устойчивые к селективному антибиотику спектиномицину. ПЦР-анализ в присутствии ген-специфичных праймеров подтвердил интеграцию целевой вставки в растительный геном. Последующие нозерн- и вестернблот анализы препаратов РНК и белковых экстрактов из полученных растений показали экспрессию целевого гена на транскрипционном и трансляционном уровне. Содержание рекомбинантного белка составило ~0.9 % от общего растворимого белка. Несмотря на задержку роста и более бледную окраску листьев по сравнению с растениями дикого типа, транспластомные растения нормально развивались и завязывали семена. Оценка гомопластидности методом Саузерна выявила гетерогенность пластидных геномов полученных растений, обусловленную генетической рекомбинацией между эндогенными и привнесенными в составе конструкции хлоропластными регуляторными ДНК-последовательностями. Методом металл-аффинной хроматографии была проведена очистка рекомбинантного белка из растительной ткани. В дальнейшем планируется изучить способность продуцируемого хлоропластами белка индуцировать вируснейтрализующие антитела против штаммов вируса оспы овец.
Sheep pox has a wide geographical range of distribution and poses a threat to sheep breeding worldwide, as the disease is highly contagious and is accompanied by large economic losses. Vaccines based on live attenuated virus strains are currently being used for prevention of this disease. Such vaccines are effective, but potentially dangerous because of the possible virus reversion to a pathogenic state. The development of safe recombinant subunit vaccines against sheep pox is very relevant. The high ploidy level of the plant chloroplasts makes it possible to obtain large quantities of foreign proteins. The purpose of this study was to create transplastomic Nicotiana tabacum plants producing one of the candidate vaccine proteins of sheep pox virus L1R. A vector containing a deletion variant of the SPPV_56 gene, which encodes the N-terminal hydrophilic part of the viral coat protein L1R, was constructed to transform tobacco plastids. It provides integration of the transgene into the trnG/trnfM region of the chloroplast tobacco genome by homologous recombination. Spectinomycin-resistant tobacco lines were obtained by biolistic gun-mediated genetic transformation. PCR analysis in the presence of gene-specific primers confirmed integration of the transgene into the plant genome. Subsequent Northern and Western blot analysis showed the gene expression at the transcriptional and translational levels. The recombinant protein yields reached up to 0.9 % of total soluble protein. The transplastomic plants displayed a growth retardation and pale green leaf color compared to the wild type, but they developed normally and produced seeds. Southern blot analysis showed heteroplasmy of the plastids in the obtained plants due to recombination events between native and introduced regulatory plastid DNA elements. The recombinant protein from plant tissue was purified using metal affinity chromatography. Future research will be focused on determining the potential of the chloroplast-produced protein to induce neutralizing antibodies against SPPV strains.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.