Выяснение путей распространения инфекции и идентификация источников патогена являются актуальными проблемами в системе профилактических мероприятий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями человека и животных. Быстрый и точный метод идентификации бактериальных штаммов (генотипирование) позволяет на научной основе планировать противоэпизоотические мероприятия. Несмотря на обилие методов генотипирования микроорганизмов, не существует унифицированного подхода, применимого к разным видам патогенов. В исследовании была поставлена цель – разработать метод генотипирования, позволяющий идентифицировать штаммы E. coli, циркулирующие у кур различных птицефабрик России. Метод основан на ранее выдвинутой нами идее двойного расщепления и избирательного мечения рестрикционных фрагментов ДНК (ДРИМ). Геномная ДНК микроорганизма расщепляется одновременно двумя ферментами рестрикции и метится биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом с помощью ДНК-полимеразы. Ферменты подбираются in silico для каждого вида микроорганизма таким образом, чтобы в результате получить ограниченное число меченых фрагментов ДНК, которые легко разделить в обычном агарозном геле. В ходе выполнения экспериментальной работы на изолятах E. coli были доказаны воспроизводимость метода и его высокая дискриминационная способность. Данный подход был реализован при генотипировании ряда других патогенных микроорганизмов. К числу преимуществ предлагаемого метода относятся быстрота выполнения анализа, доступность реактивов и приборов. Показаны передача возбудителя между курами в пределах одной птицефабрики и возможность присутствия в разных органаходной особи генетически близких штаммов E. coli. Для генотипирования подходят бактериальные изоляты кур, выделенные из любых органов, кроме желудочно-кишечного тракта. В кишечнике присутствуют эндогенные бактериальные штаммы E. coli, что затрудняет интерпретацию результатов генотипирования. В работе показана возможность использования метода ДРИМ на полевых изолятах E. coli для решения вопросов молекулярной эпизоотологии.
Tracing of transmission routes and identification of pathogen sources are important issues in preventive measures aimed at controlling human and animal infectious diseases. A fast and accurate method for bacterial strain identification (genotyping) allows scientifically sound planning of preventive schemes. Despite the existence of numerous bacterium genotyping techniques, there is still room for developing a unified typing approach that would be applicable to a variety of bacterial species. The aim is to develop a genotyping method allowing identification of E. coli strains circulating at Russian chicken farms. The method is based on the earlier proposed idea of double digestion and selective labeling of DNA restriction fragments (DDSL). Bacterial genomic DNA is simultaneously digested with two restriction enzymes and labeled with biotinylated deoxynucleoside triphosphates with the presence of DNA polymerase. The enzymes are chosen in silico for each bacterial species so that a limited number of DNA fragments be generated for subsequent separation in conventional agarose gel. After implementation of the study with E. coli isolates, adequate reproducibility and high discriminatory power of the technique were demonstrated. This approach was previously applied to genotyping other pathogenic bacterial species. The advantages of the proposed technique are the short turn-around time of analysis and easy availability of reagents and equipment. Transmission of a pathogen among chicken within one farm and existence of slightly different E. coli genotypes in various organs of the same individual were observed. Bacterial isolates obtained from any organ except the intestine were suitable for genotyping. Chicken intestine contains endogenous E. coli strains, which hamper the interpretation of genotyping data obtained for a set of isolates. Thus, our work demonstrates the potential of the DDSL method for genotyping field E. coli isolates in the context of molecular epizootology.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.