vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/vjgb-24-16vavilov-4083Research ArticleМОЛЕКУЛЯРНАЯ И КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯMOLECULAR AND CELL BIOLOGYОценка клеточных линий с индуцируемой деплецией компонентов когезина и конденсинов посредством анализа морфологии метафазных хромосомAssessing cell lines with inducible depletion of cohesin and condensins components through analysis of metaphase chromosome morphologyЮнусоваА. М.YunusovaA. M.

Новосибирск

Novosibirsk

СмирновА. В.SmirnovA. V.

Новосибирск

Novosibirsk

ПристяжнюкИ. Е.PristyazhnukI. E.

Новосибирск

Novosibirsk

ШнайдерТ. А.ShnaiderT. A.

Новосибирск

Novosibirsk

МальцеваЕ. К.MaltsevaE. K.

Новосибирск

Novosibirsk

АфонниковаС. Д.AfonnikovaS. D. 

Новосибирск

Novosibirsk

ГусевО. А.GusevO. A.

Москва

Казань

Moscow

Kazan

БаттулинН. Р.BattulinN.  R.

Новосибирск

Novosibirsk

battulin@gmail.comФедеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наукРоссияInstitute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesRussian FederationНовосибирский национальный исследовательский государственный университетРоссияNovosibirsk State UniversityRussian FederationLife Improvement by Future Technologies (LIFT) Center; Казанский федеральный университет; Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияLife Improvement by Future Technologies (LIFT) Center; Kazan Federal University; Endocrinology Research CenterRussian FederationФедеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университетРоссияInstitute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State UniversityRussian Federation202411042024282138147Copyright © Юнусова А.М., Смирнов А.В., Пристяжнюк И.Е., Шнайдер Т.А., Мальцева Е.К., Афонникова С.Д., Гусев О.А., Баттулин Н.Р., 20242024Юнусова А.М., Смирнов А.В., Пристяжнюк И.Е., Шнайдер Т.А., Мальцева Е.К., Афонникова С.Д., Гусев О.А., Баттулин Н.Р.Yunusova A.M., Smirnov A.V., Pristyazhnuk I.E., Shnaider T.A., Maltseva E.K., Afonnikova S.D., Gusev O.A., Battulin N.R.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/4083

Одна из самых продуктивных стратегий поиска функций различных белков – исследование последствий потери функции белка. Часто для этого получают клетки или организмы с нокаутом гена, кодирующего белок интереса. Однако многие белки выполняют настолько важные функции, что клетка или организм резко теряют жизнеспособность при потере функции такого белка. Для этих белков наиболее продуктивной стратегией является применение систем индуцируемой деградации белка. Часто используют систему ауксин-зависимой деградации белков. Для применения этой системы достаточно ввести в клетки млекопитающих трансген, кодирующий растительную ауксин-зависимую убиквитин лигазу, и влючить в ген интереса последовательность, кодирующую дегроновый домен. Важный этап создания клеток, способных к индуцируемой деплеции белка, – отбор клеточных клонов с эффективной ауксин-зависимой деградацией белка интереса. Для отбора клонов с индуцируемой деплецией архитектурных белков хроматина RAD21 (компонент когезинового комплекса) и SMC2 (компонент конденсинового комплекса) мы предлагаем использовать морфологию метафазных хромосом как удобный функциональный тест. В данной работе мы получили серию клонов клеток человека HAP1, несущих необходимые генетические конструкции для индуцируемой деплеции RAD21 и SMC2. Эффективность деградации белка интереса была оценена с помощью проточной цитофлуориметрии, Вестерн-блоттинга и теста на морфологию метафазных хромосом. На основе проведенных тестов мы продемонстрировали, что созданные нами клоны с дегроном SMC2 эффективно и полно теряют функцию белка при индукции ауксином. При этом ни один из созданных нами клонов HAP1 с дегроном RAD21 не показал полной потери функции RAD21 при индукции деградации ауксином. Кроме того, некоторые клоны имели признаки потери функции RAD21 даже в отсутствие индукции. Использованный нами тест на морфологию хромосом оказался удобным и информативным для отбора клонов. Результаты этого теста хорошо согласуются с данными проточной цитофлуориметрии анализа и Вестерн-блоттинга. 

One of the most productive strategies for finding the functions of proteins is to study the consequences of loss of protein function. For this purpose, cells or organisms with a knockout of the gene encoding the protein of interest are obtained. However, many proteins perform important functions and cells or organisms could suddenly lose fitness when the function of a protein is lost. For such proteins, the most productive strategy is to use in ducible protein degradation systems. A system of auxin-dependent protein degradation is often implemented. To use this system, it is sufficient to introduce a transgene encoding a plant-derived auxin-dependent ubiquitin ligase into mammalian cells and insert a sequence encoding a degron domain into the gene of interest. A crucial aspect of development of cell lines engineered for inducible protein depletion is the selection of cell clones with efficient  auxin-dependent degradation of the protein of interest. To select clones induced by depletion of the architectural chromatin proteins RAD21 (a component of the cohesin complex) and SMC2 (a component of the condensin complex), we propose to use the morphology of metaphase chromosomes as a convenient functional test. In this work, we obtained a series of clones of human HAP1 cells carrying the necessary genetic constructs for inducible depletion of RAD21 and SMC2. The degradation efficiency of the protein of interest was assessed by flow cytometry, Western blotting and metaphase chromosome morphology test. Based on our tests, we showed that the clones we established with the SMC2 degron effectively and completely lose protein function when induced by auxin. However, none of the HAP1 clones we created with the RAD21 degron showed complete loss of RAD21 function upon induction of degradation by auxin. In addition, some clones showed evidence of loss of RAD21 function even in the absence of induction. The chromosome morphology test turned out to be a convenient and informative method for clone selection. The results of this test are in good agreement with flow cytometry analysis and Western blotting data.

SMC белкидегронконденсация хромосомSMC proteinsdegronchromosome condensationWe thank Masato Kanemaki for sharing the HCT-116 RAD21-mAC and SMC2-mAC cell lines. This work was supported by Russian Science Foundation grant No. 23-74-00055. Cell culture was performed at the Collective Center of ICG SB RAS “Collection of Pluripotent Human and Mammalian Cell Cultures for Biological and Biomedical Research” , project number FWNR-2022=0019 (https://ckp.icgen.ru/cells/; http://www.biores.cytogen.ru/ brc_cells/collections/ICG_SB_RAS_CELL). Cryoarchiving and primary analysis of control cell lines HCT-116 RAD21-mAC and SMC2-mAC was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, grant 075-15-2021-1344.ReferencesBaker M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 2015;521(7552):274-276. DOI 10.1038/521274aBaker M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 2015;521(7552):274-276. DOI 10.1038/521274ade Wit E., Nora E.P. New insights into genome folding by loop ex- trusion from inducible degron technologies. Nat. Rev. Genet. 2023; 24(2):73-85. DOI 10.1038/s41576-022-00530-4de Wit E., Nora E.P. New insights into genome folding by loop ex- trusion from inducible degron technologies. Nat. Rev. Genet. 2023; 24(2):73-85. DOI 10.1038/s41576-022-00530-4Gibcus J.H., Samejima K., Goloborodko A., Samejima I., Naumova N., Nuebler J., Kanemaki M.T., Xie L., Paulson J.R., Earnshaw W.C., Mirny L.A., Dekker J. A pathway for mitotic chromosome formation. Science. 2018;359(6376):eaao6135. DOI 10.1126/science.aao6135Gibcus J.H., Samejima K., Goloborodko A., Samejima I., Naumova N., Nuebler J., Kanemaki M.T., Xie L., Paulson J.R., Earnshaw W.C., Mirny L.A., Dekker J. A pathway for mitotic chromosome formation. Science. 2018;359(6376):eaao6135. DOI 10.1126/science.aao6135Kabirova E., Nurislamov A., Shadskiy A., Smirnov A., Popov A., Salnikov P., Battulin N., Fishman V. Function and evolution of the loop extrusion machinery in animals. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(5):5017. DOI 10.3390/ijms24055017Kabirova E., Nurislamov A., Shadskiy A., Smirnov A., Popov A., Salnikov P., Battulin N., Fishman V. Function and evolution of the loop extrusion machinery in animals. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(5):5017. DOI 10.3390/ijms24055017Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-target CRISPR/Cas9 activity can cause undesigned large deletion in mouse zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(10):3604. DOI 10.3390/ijms21103604Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-target CRISPR/Cas9 activity can cause undesigned large deletion in mouse zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(10):3604. DOI 10.3390/ijms21103604Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras. Cell Tissue Res. 2008;334(3):371-380. DOI 10.1007/s00441-008-0702-9Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras. Cell Tissue Res. 2008;334(3):371-380. DOI 10.1007/s00441-008-0702-9Li S., Prasanna X., Salo V.T., Vattulainen I., Ikonen E. An efficient auxin-inducible degron system with low basal degradation in human cells. Nat. Methods. 2019;16(9):866-869. DOI 10.1038/s41592-019-0512-xLi S., Prasanna X., Salo V.T., Vattulainen I., Ikonen E. An efficient auxin-inducible degron system with low basal degradation in human cells. Nat. Methods. 2019;16(9):866-869. DOI 10.1038/s41592-019-0512-xLitwin I., Pilarczyk E., Wysocki R. The emerging role of cohesin in the DNA damage response. Genes (Basel). 2018;9(12):581. DOI 10.3390/genes9120581Litwin I., Pilarczyk E., Wysocki R. The emerging role of cohesin in the DNA damage response. Genes (Basel). 2018;9(12):581. DOI 10.3390/genes9120581Losada A., Hirano M., Hirano T. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev. 1998;12(13):1986-1997. DOI 10.1101/gad.12.13.1986Losada A., Hirano M., Hirano T. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev. 1998;12(13):1986-1997. DOI 10.1101/gad.12.13.1986Nabet B., Roberts J.M., Buckley D.L., Paulk J., Dastjerdi S., Yang A., Leggett A.L., Erb M.A., Lawlor M.A., Souza A., Scott T.G., Vittori S., Perry J.A., Qi J., Winter G.E., Wong K.-K., Gray N.S., Bradner J.E. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nat. Chem. Biol. 2018;14:431-441. DOI 10.1038/s41589-018-0021-8Nabet B., Roberts J.M., Buckley D.L., Paulk J., Dastjerdi S., Yang A., Leggett A.L., Erb M.A., Lawlor M.A., Souza A., Scott T.G., Vittori S., Perry J.A., Qi J., Winter G.E., Wong K.-K., Gray N.S., Bradner J.E. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nat. Chem. Biol. 2018;14:431-441. DOI 10.1038/s41589-018-0021-8Nuebler J., Fudenberg G., Imakaev M., Abdennur N., Mirny L.A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018;115(29): E6697-E6706. DOI 10.1073/pnas.1717730115Nuebler J., Fudenberg G., Imakaev M., Abdennur N., Mirny L.A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018;115(29): E6697-E6706. DOI 10.1073/pnas.1717730115Phanindhar K., Mishra R.K. Auxin-inducible degron system: an efficient protein degradation tool to study protein function. Biotechniques. 2023;74(4):186-198. DOI 10.2144/btn-2022-0108Phanindhar K., Mishra R.K. Auxin-inducible degron system: an efficient protein degradation tool to study protein function. Biotechniques. 2023;74(4):186-198. DOI 10.2144/btn-2022-0108Seitan V.C., Hao B., Tachibana-Konwalski K., Lavagnolli T., MiraBontenbal H., Brown K.E., Teng G., Carroll T., Terry A., Horan K., Marks H., Adams D.J., Schatz D.G., Aragon L., Fisher A.G., Krangel M.S., Nasmyth K., Merkenschlager M. A role for cohesin in T- cell-receptor rearrangement and thymocyte differentiation. Nature. 2011;476(7361):467-471. DOI 10.1038/nature10312Seitan V.C., Hao B., Tachibana-Konwalski K., Lavagnolli T., MiraBontenbal H., Brown K.E., Teng G., Carroll T., Terry A., Horan K., Marks H., Adams D.J., Schatz D.G., Aragon L., Fisher A.G., Krangel M.S., Nasmyth K., Merkenschlager M. A role for cohesin in T- cell-receptor rearrangement and thymocyte differentiation. Nature. 2011;476(7361):467-471. DOI 10.1038/nature10312Yesbolatova A., Saito Y., Kitamoto N., Makino-Itou H., Ajima R., Nakano R., Nakaoka H., Fukui K., Gamo K., Tominari Y., Takeuchi H., Saga Y., Hayashi K., Kanemaki M.T. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat. Commun. 2020;11(1):5701. DOI 10.1038/s41467-020-19532-zYesbolatova A., Saito Y., Kitamoto N., Makino-Itou H., Ajima R., Nakano R., Nakaoka H., Fukui K., Gamo K., Tominari Y., Takeuchi H., Saga Y., Hayashi K., Kanemaki M.T. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat. Commun. 2020;11(1):5701. DOI 10.1038/s41467-020-19532-zYu K., Liu C., Kim B.-G., Lee D.-Y. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol. Adv. 2015;33(1):155-164. DOI 10.1016/j.biotechadv.2014.11.005Yu K., Liu C., Kim B.-G., Lee D.-Y. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol. Adv. 2015;33(1):155-164. DOI 10.1016/j.biotechadv.2014.11.005Yunusova A., Smirnov A., Shnaider T., Lukyanchikova V., Afonnikova S., Battulin N. Evaluation of the OsTIR1 and AtAFB2 AID systems for genome architectural protein degradation in mammalian cells. Front. Mol. Biosci. 2021;8:757394. DOI 10.3389/fmolb.2021.757394Yunusova A., Smirnov A., Shnaider T., Lukyanchikova V., Afonnikova S., Battulin N. Evaluation of the OsTIR1 and AtAFB2 AID systems for genome architectural protein degradation in mammalian cells. Front. Mol. Biosci. 2021;8:757394. DOI 10.3389/fmolb.2021.757394Zhang M., Zhao Y., Liu X., Ruan X., Wang P., Liu L., Wang D., Dong W., Yang C., Xue Y. Pseudogene MAPK6P4-encoded functional peptide promotes glioblastoma vasculogenic mimicry develop ment. Commun. Biol. 2023;6(1):1059. DOI 10.1038/s42003-023-05438-1Zhang M., Zhao Y., Liu X., Ruan X., Wang P., Liu L., Wang D., Dong W., Yang C., Xue Y. Pseudogene MAPK6P4-encoded functional peptide promotes glioblastoma vasculogenic mimicry develop ment. Commun. Biol. 2023;6(1):1059. DOI 10.1038/s42003-023-05438-1

The authors declare that there are no conflicts of interest present.