vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/VJ15.047vavilov-421Research ArticleЭПИГЕНЕТИКА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВCRYOPRESERVATION AND REPRODUCTIVE TECHNOLOGIESСравнение различных сочетаний криопротекторов и методов оттаивания при криоконсервации эмбрионов мышей и крысA comparison of different cryoprotectant solutions and thawing methods for cryo­preservation of embryos of mice and ratsИгонинаТ. Н.IgoninaT. N.БрусенцевЕ. Ю.BrusentsevE. Yu.РожковаИ. Н.RozhkovaI. N.НапримеровВ. А.NaprimerovV. A.АмстиславскийС. Я.AmstislavskyS. Ya.amstis@bionet.nsc.ruФедеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск, РоссияРоссияInstitute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, RussiaRussian Federation201530112015194378382Copyright © Игонина Т.Н., Брусенцев Е.Ю., Рожкова И.Н., Напримеров В.А., Амстиславский С.Я., 20152015Игонина Т.Н., Брусенцев Е.Ю., Рожкова И.Н., Напримеров В.А., Амстиславский С.Я.Igonina T.N., Brusentsev E.Y., Rozhkova I.N., Naprimerov V.A., Amstislavsky S.Y.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/421

Выбор криопротектора, способа оттаивания эмбрионов влияет на эффективность процесса криоконсервации. Cпособ замораживания и оттаивания эмбрионов, нацеленный на сохраение бластомеров, был подобран на мышах линии ICR. В работе получали эмбрионы мышей линии ICR, а также крыс линий GC и OXYS на стадии дробящихся зародышей на третий день после спаривания и производили их замораживание по стандартной программе в пластиковых соломинах. На мышах ICR cравнивали влияние проникающих (этиленгликоль, глицерин) и не проникающих (сахароза) криопротекторов в их комбинации на выживание эмбрионов после замораживания. В этом же эксперименте сравнивали более быстрый (10 с на водяной бане при 37 °С) и более медленный (40 с при комнатной температуре, затем 40 с на водяной бане при 30 °С) способы оттаивания зародышей. Жизнеспособность эмбрионов мышей и крыс после процедур криоконсервации оценивалась путем их культивирования in vitro. Наши данные, полученные на мышах, свидетельствуют о том, что «медленное» оттаивание лучше подходит для выживания эмбрионов, чем «быстрое» оттаива- ние; добавление сахарозы к основному криопротектору (этиленгликолю или глицерину) улучшает показатели развития эмбрионов in vitro после оттаивания, особенно когда криопротектором является глицерин. Именно этот способ замораживания–оттаивания эмбрионов (глицерин с сахарозой в качестве криопротекторов, «медленное» оттаивание) был использован при работе с крысами линий GC и OXYS, при этом 68–83,3 % всех зародышей успешно пережили криоконсервацию, из них 64,7–66,6 % – успешно развивались в культуре.

The proper choice of cryoprotectant and thawing method affects cryopreservation efficiency. A freezing-thawing method for sparing embryonic cells was evaluated in experiments with ICR mice. Cleavage-stage embryos of ICR mice, GC rats, and OXYS rats were collected on Day 3 of pregnancy and frozen in plastic straws according to a standard protocol. Permeating (ethylene glycol and glycerol) and nonpermeating (sucrose) cryoprotectants and their combinations were compared during the freezing of ICR mouse embryos. With these mice, two thawing methods were compared: rapid (water bath, 10 s, 37 °С) and slow (40 s, room temperature; 40 s, 30 °С). Embryo viability in mice and rats was evaluated by their in vitro culturing after thawing. Our data on mice indicate that slow thawing is more suitable for sparing the integrity of embryonic cells; moreover, supplementation of the main cryoprotectant (either ethylene glycol or glycerol) with sucrose is beneficial for subsequent in vitro culture, especially in the case of glycerol. This freezing-thawing protocol (with glycerol and sucrose as cryoprotectant agents and slow thawing) was applied to rats of the GC and OXYS strains; the survival rate after cryopreservation was 68–83.3 %, and the rate of in vitro development was 64.7–66.6 %.

мыши ICRкрысы GCOXYSкриоконсервация эмбрионовэтиленгликольглицеринсахарозаICR miceGC ratsOXYS ratsembryo cryopreservationethylene glycolglycerolsucroseИЦиГ СО РАН, Минобрнауки России, Е.А.ГалустянReferencesАмстиславский С.Я. Эмбриотехнологические подходы к сохранению исчезающих видов млекопитающих. Дис. … д-ра биол. наук. Новосибирск, 2006.Abbott A. Geneticists prepare for deluge of mutant mice. Nature. 2004; 432:541. DOI: 10.1038/432541aАмстиславский С.Я., Игонина Т.Н., Рожкова И.Н., Брусенцев Е.Ю., Роговая А.А., Рагаева Д.С., Напримеров В.А., Литвинова Е.А., Плюснина И.Ф., Маркель А.Л. Редеривация путем трансплантации эмбрионов линий лабораторных мышей и крыс. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013;17(1):147-161.Amstislavsky S.Ya. Embriotekhnologicheskie podkhody k sokhraneniyu ischezayushchikh vidov mlekopitayushchikh. Diss. dokt. biol. nauk [Embryotechnological approaches to conservation of endangered mammalian species: Dr. biol. sci. diss.]. Novosibirsk, 2006.Брусенцев Е.Ю., Напримеров В.А., Амстиславский С.Я. Редеривация как способ очистки лабораторных животных. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011;15(1):102-113.Amstislavsky S., Brusentsev E., Kizilova E., Igonina T., Abramova T., Rozhkova I. Embryo cryopreservation and in vitro culture of preimplantation embryos in Campbell’s hamster (Phodopus campbelli). Theriogenology. 2015;82:1056-1063. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2014.12.013Рожкова И.Н., Брусенцев Е.Ю., Амстиславский С.Я. Оболочки преимплантационных зародышей млекопитающих как мишень репродуктивных технологий. Онтогенез. 2012;43(5):1-11.Amstislavsky S.Ya., Igonina T.N., Rozhkova I.N., Brusentsev E.Yu., Rogovaya A.A., Ragaeva D.S., Naprimerov V.A., Litvinova E.A., Plyusnina I.Z., Markel A.L. Rederivation by embryo transfer in strains of laboratory mice and rats. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii – Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2013;17(1):147-161.Abbott A. Geneticists prepare for deluge of mutant mice. Nature. 2004; 432:541. DOI: 10.1038/432541aBrusentsev E.Yu., Naprimerov V.A., Amstislavsky S.Ya. Rederivation as a means for laboratory animal purification. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii – Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2011;15(1):102-113.Amstislavsky S., Brusentsev E., Kizilova E., Igonina T., Abramova T., Rozhkova I. Embryo cryopreservation and in vitro culture of preimplantation embryos in Campbell’s hamster (Phodopus campbelli). Theriogenology. 2015; 82:1056-1063. DOI: 10.1016/j.therigen logy.2014.12.013Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S., Biramanel J., Englert Y. Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts. Hum. Reprod. 2000;4:905-910. DOI: humrep/15.4.905Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S., Biramanel J., Englert Y. Comparison of ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blastocysts. Hum. Reprod. 2000;4:905-910. DOI: 10.1093/hum-rep/15.4.905Lasar J., Moreno C., Jacob H., Kwitek A. Impact of genomics on research in rats. Genome Res. 2005;15:1717-1728. DOI: 10.1101/gr.3744005Lasar J., Moreno C., Jacob H., Kwitek A. Impact of genomics on research in rats. Genome Res. 2005;15: 1717- 1728. DOI: 10.1101/gr.3744005McWilliams R.B., Gibbons W., Leibo S. Osmotic and physiological responses of mouse zygotes and human oocytes to mono- and disaccharides. Hum. Reprod. 1995;10:1163-1171. DOI: 10.5.1163McWilliams R.B., Gibbons W., Leibo S. Osmotic and physiological responses of mouse zygotes and human oocytes to mono- and disac-charides. Hum. Reprod. 1995;10:1163- 1171. DOI: 10.5.1163Miyoshi K., Abeydeera L.R., Okuda K., Niwa K. Effects of osmolarity and amino acids in a chemically defined medium on development of rat one-cell embryos. J. Reprod. Fertil. 1995;103(1):27-32. DOI:10.1530/jrf.0.1030027Miyoshi K., Abeydeera L.R., Okuda K., Niwa K. Effects of osmolarity and amino acids in a chemically defined medium on development of rat one-cell embryos. J. Reprod. Fertil. 1995;103(1):27-32. DOI: 10.1530/jrf.0.1030027Morrell J.M. Techniques of embryo transfer and facility decontamination used to improve the health and welfare of transgenic mice. Lab. Anim. 1999;33:201-206. DOI: 10.1258/002367799780578165Morrell J.M. Techniques of embryo transfer and facility decontamination used to improve the health and welfare of transgenic mice. Lab. Anim. 1999;33:201-206. DOI: 10.1258/002367799780578165Pedro P.B., Yokoyama E., Zhu S.E., Yoshida N., Valdez D.M. Jr., Tanaka M., Edashige K., Kasai M. Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants. J. Reprod. Dev. 2005;2:235-246. DOI: 10.1262/jrd.16079Pedro P.B., Yokoyama E., Zhu S.E., Yoshida N., Valdez D.M. Jr., Tanaka M., Edashige K., Kasai M. Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants. J. Reprod. Dev. 2005;2:235-246. DOI: 10.1262/jrd.16079Pfaff R.T., Agca Y., Liu J., Woods E.J., Peter A.T., Critser J.K. Cryobiology of rat embryos I: determination of zygote membrane permeability coefficients for water and cryoprotectants, their activation energies, and the development of improved cryopreservation methods. Biol. Reprod. 2000;63:1294-1302. DOI: 10.1095/biolreprod63.5.1294Pfaff R.T., Agca Y., Liu J., Woods E.J., Peter A.T., Critser J.K. Cryobiology of rat embryos I: determination of zygote membrane permeability coefficients for water and cryoprotectants, their activation energies, and the development of improved cryopreservation methods. Biol. Reprod. 2000;63: 1294-1 DOI: 10.1095/biolreprod63.5.1294Rall W.F., Schmidt P.M., Lin X., Brown S.S., Ward A.C., Hansen C.T. Factors affecting the efficiency of embryo cryopreservation and rederivation of rat and mouse models. ILAR J. 2000;41:221-227. DOI: 10.1093/ilar.41.4.221Rall W.F., Schmidt P.M., Lin X., Brown S.S., Ward A.C., Hansen C.T. Factors affecting the efficiency of embryo cryopreservation and rederivation of rat and mouse models. ILAR J. 2000;41:221-227. DOI: 10.1093/ilar.41.4.221Renard J.P., Babinet C. High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant. J. Exp. Zool. 1984;230:443-448. DOI: 10.1002/jez.1402300313Renard J.P., Babinet C. High survival of mouse embryos after rapid freezing and thawing inside plastic straws with 1-2 propanediol as cryoprotectant. J. Exp. Zool. 1984;230:443-448. DOI: 10.1002/jez.1402300313Ridha M.T., Dukelow W.R. The developmental potential of frozenthawed hamster preimplantation embryos following embryo transfer: viability of slowly frozen embryos following slow and rapid thawing. Anim. Reprod. Sci. 1985;9:253-259. DOI: 10.1016/0378-4320(85)90008-9Ridha M.T., Dukelow W.R. The developmental potential of frozenthawed hamster preimplantation embryos following embryo transfer: viability of slowly frozen embryos following slow and rapid thawing. Anim. Reprod. Sci. 1985;9:253-29. DOI: 10.1016/03784320(85)90008-9Rozhkova I.N., Brusentsev E.Yu., Amstislavsky S.Ya. Coats of preimplantation mammalian embryos as a target of reproductive technologies. Ontogenez – Ontogeny. 2012;43(5):1-11.Rulicke T., Autenried P. Potential of two-cell mouse embryos to develop to term despite partial damage after cryopreservation. Lab. Anim. 1995;29:320-326. DOI: 10.1258/002367795781088252Rulicke T., Autenried P. Potential of two-cell mouse embryos to develop to term despite partial damage after cryopreservation. Lab. Anim. 1995;29:320-326. DOI: 10.1258/002367795781088252Van Soom A., Wrathall A.E., Herrler A., Nauwynck H.J. Is the zona pellucida an efficient barrier to viral infection? Reprod. Fertil. Dev. 2010;22:21-31. DOI: 10.1071/RD D0923Van Soom A., Wrathall A.E., Herrler A., Nauwynck H.J. Is the zona pellucida an efficient barrier to viral infection? Reprod. Fertil. Dev. 2010;22:21-31. DOI: 10.1071/RD09230

The authors declare that there are no conflicts of interest present.