Новосибирск
Novosibirsk
Новосибирск
Novosibirsk
Новосибирск
Novosibirsk
Недавно нами был предложен новый класс производных нуклеиновых кислот – фосфорамидные бензоазольные олигонуклеотиды. В них один из немостиковых атомов кислорода замещен на фосфорамидную Nбензоазольную группу: бензимидазольную, диметилбензимидазольную, бензоксазольную или бензотиазольную. Изучение свойств таких производных показало, что их применение в ПЦР увеличивает специфичность и селективность анализа. Данное исследование посвящено изучению влияния фосфорамидной N-бензимидазольной модификации ДНК-праймеров на эффективность их удлинения Taq ДНКполимеразой при помощи метода молекулярной динамики. Мы рассматривали совершенные комплексы нуклеиновых кислот с модификациями в положениях с первого по шестое считая от 3’конца праймера. Ранее было показано, что степень подавления элонгации зависит от положения модификации: чем ближе к 3’концу, тем сильнее ингибирование, а максимальное подавление наблюдается при модификации в первом положении, особенно в несовершенных комплексах. Кроме того, в экспериментах наблюдались продукты неполного удлинения праймеров с модификацией в четвертом положении. Проведенные компьютерное моделирование и анализ позволили выявить молекулярные механизмы взаимодействия модифицированных праймеров с ферментом, включая стерические препятствия для продвижения полимеразы по модифицированной цепи и локальные нарушения структуры ДНК, которые объясняют наблюдаемые экспериментально закономерности. Установлено, что как различные стереоизомеры фосфорамидных групп, так и конформеры фосфорамидной N-бензимидазольной группы по-разному влияют на структуру ферментсубстратного комплекса и эффективность взаимодействия Taq ДНК-полимеразы с модифицированным ДНК- комплексом. Модификация первого и второго межнуклеозидного фосфатного остатка с 3’конца праймера в наибольшей степени возмущает структуру белковонуклеинового комплекса, а при расположении модификации в четвертом фосфатном остатке Nбензимидазольная модификация располагается в кармане фермента. Полученные результаты открывают перспективы для рационального конструирования специфичных, обладающими заранее заданными свойствами ДНК-праймеров с модифицированными Nбензимидазольными межнуклеотидными звеньями для использования в ПЦР-диагностике.
We recently proposed a novel class of nucleic acid derivatives – phosphoramidate benzoazole oligonucleotides (PABAOs). In these compounds, one of the nonbridging oxygen atoms is replaced by a phosphoramidate N-benzoazole group, such as benzimidazole, dimethylbenzimidazole, benzoxazole, or benzothiazole. Studies of the properties of these derivatives have shown that their use in PCR enhances the specificity and selectivity of the analysis. The study investigates the effect of phosphoramide N-benzimidazole modification of DNA primers on their elongation by Taq DNA polymerase using molecular dynamics simulations. We examined perfectly matched primertemplate complexes with modifications at positions one through six from the 3’end of the primer. Prior experimental work demonstrated that the degree of elongation suppression depends on the modification position: the closer to the 3’end, the stronger the inhibition, with maximal suppression observed for the first position, especially in mismatched complexes. Furthermore, incomplete elongation products were experimentally observed for primers modified at the fourth position. Our molecular dynamics simulations and subsequent analysis revealed the molecular mechanisms underlying the interaction of modified primers with the enzyme. These include steric hindrance that impedes polymerase progression along the modified strand and local distortions in the DNA structure, which explain the experimentally observed trends. We established that both different stereoisomers of the phosphoramidate groups and conformers of the phosphoramidate N-benzimidazole moiety differentially affect the structure of the enzymesubstrate complex and the efficiency of Taq DNA polymerase interaction with the modified DNA complex. Modification of the first and second in ternucleoside phosphate from the 3’end of the primer causes the most significant perturbation to the structure of the proteinnucleic acid complex. When the modification is located at the fourth phosphate group, the Nbenzimidazole moiety occupies a specific pocket of the enzyme. These findings provide a foundation for the rational design of specificDNA primers bearing modified N-benzimidazole moieties with tailored properties for use in PCR diagnostics.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.