Саратов
Saratov
Уфа
Ufa
Саратов
Saratov
Саратов
Saratov
Саратов
Saratov
Сайт-направленный мутагенез посредством генетических конструкций, несущих систему CRISPR/Cas, считается эффективной технологией, активно применяемой для решения самых разных задач генетики и селекции у многих возделываемых культур. Зерновое сорго – уникальная по своей засухоустойчивости и жаростойкости злаковая культура, служащая источником кормов и пищевого зерна в аридных регионах земного шара, приобретающая все большее значение в условиях глобального потепления климата. Одной из основных задач селекции сорго явля ется улучшение сравнительно низкой питательной ценности зерна, обусловленной в том числе устойчивостью его запасных белков – кафиринов – к протеолитическому расщеплению. Нами ранее путем использования технологии CRISPR/Cas у зернового сорго сорта Аванс были получены мутанты с улучшенной перевариваемостью кафиринов в системе in vitro. При этом в качестве мишени был выбран один из членов генного семейства, кодирующего 22 кДа α-кафирин, а именно ген k1C5. Цель данного исследования – изучение потомства полученных нами ранее растений, несущих мутации в гене k1C5, отличающихся улучшенной перевариваемостью белков зерна в системе in vitro, а имен но: анализ наследования высокой перевариваемости, проявления основных селекционно ценных признаков, а также выявление структуры нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный полипептид 22 кДа α-кафирина у ряда растений из поколения Т0 и их потомства T1. Обнаружено, что у четырех из шести изученных растений Т0, а также у их потомства присутствует одна и та же мутация: замена Т→С в 23-й позиции нуклеотидной последователь ности гена k1C5, кодирующей сигнальный полипептид, которая привела к замене кодирующего триплета CTC→CCC (Leu→Pro). Эта мутация располагается за пределами выбранной мишени, в направлении 3’ от последовательности PAM. Высказывается предположение, что данная мутация могла возникнуть в результате ошибок нуклеазы Cas9, обу словленных наличием нескольких последовательностей PAM, расположенных близко друг к другу. Установлено, что потомство двух из трех изученных мутантов (семьи T2 и Т3), выращенное в условиях опытного поля, отличалось от исходного сорта сниженной высотой растения (на 12.4–15.5 %). Длина цветоножки, масса 1000 зерен и масса зерна с метелки не отличались от исходного сорта, за исключением потомства мутанта 2С-1.2.5b, у которого урожай зерна с метелки был снижен. В отличие от исходного сорта, у растений из поколений Т2 и Т3 присутствовали зерновки с модифицированным типом эндосперма (полностью мучнистым, либо с вкраплениями стекловидного эндосперма, либо с тонким стекловидным слоем). Уровень перевариваемости белков зерна в потомстве мутантов 2С-2.1.1 № 13 и 2С-1.2.5a № 14 варьировал от 77 до 84 %, значимо превышая показатель исходного сорта (63.4 ± 2.3 %, p < 0.05). Уровень перевариваемости белков из зерновок с модифицированным эндоспермом был выше, чем у зерновок с обычным стекловидным эндоспермом (84–93 %, p < 0.05). Обсуждаются причины варьирования текстуры эндоспер ма у потомства полученных мутантов и ее связь с высокой перевариваемостью кафиринов.
Site-directed mutagenesis using genetic constructs carrying the CRISPR/Cas system is an effective technology that is actively used to solve a variety of problems in plant genetics and breeding. One of these problems is to improve the nutritional value of grain sorghum, a high-yielding heat- and drought-tolerant cereal crop that is becoming increasingly important in the conditions of climate aridization. The main reason for the relatively low nutritional value of sorghum grain is the resistance of its storage proteins, kafirins, to proteolytic digestion. We have previously obtained mutants with improved kafirin in vitro digestibility using the CRISPR/Cas technology in grain sorghum variety Avance. The nucleotide sequence of one of the genes (k1C5) of the gene family encoding the signal polypeptide of 22 kDa α-kafirin was used as a target. The aim of this study was to investigate the manifestation of the main agronomically-important traits in the progeny of these mutants and inheritance of high in vitro protein digestibility, and also sequencing nucleotide sequences encoding the 22 kDa α-kafirin signal polypeptide in a number of plants from the T0 generation and their T1 progeny. It was revealed that four of the six studied T0 plants, as well as their progeny, had the same mutation: a T→C substitution in the 23rd position of the nucleotide sequence of the k1C5 gene encoding the signal polypeptide, which led to a substitution of the coding triplet CTC→CCC (Leu→Pro). This mutation is located off-target, 3’ from the PAM sequence. It is suggested that this mutation may have arisen as a result of Cas9 nuclease errors caused by the presence of multiple PAM sequences located close to each other. It was found that the progeny of two of the three studied mutants (T2 and T3 families), grown in the experimental field conditions, differed from the original variety by a reduced plant height (by 12.4–15.5 %). The peduncle length, 1,000-grain mass, and grain mass per panicle did not differ from the original variety, with the exception of the progeny of the 2C-1.2.5b mutant, which had a reduced grain yield per panicle. Unlike the original variety, plants from the T2 and T3 generations had kernels with a modified type of endosperm (completely floury, or floury with inclusions of vitreous endosperm, or with a thin vitreous layer). The level of grain protein digestibility in the progeny of mutants 2C-2.1.1 #13 and 2C-1.2.5a #14 varied from 77 to 84 %, significantly exceeding the original variety (63.4 ± 2.3 %, p < 0.05). The level of protein digestibility from kernels with modified endosperm was higher than that of kernels with normal vitreous endosperm (84–93 %, p < 0.05). The reasons for the variation in endosperm texture in the progeny of the mutants and its relationship with the high digestibility of kafirins are discussed.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.