vavilovВавиловский журнал генетики и селекцииVavilov Journal of Genetics and Breeding2500-3259Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the RAS10.18699/vjgb-25-123vavilov-4916Research ArticleХРОМОСОМНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯCHROMOSOME AND GENE ENGINEERINGСайленсинг гена фитоендесатуразы табака Бентхама Nicotiana benthamiana с помощью корневой обработки экзогенной дцРНКSilencing of the Nicotiana benthamiana phytoendesaturase gene by root treatment of exogenous dsRNAГолубеваТ. С.GolubevaT. S.

Новосибирск

Калининград

Novosibirsk

Kaliningrad

frolova@bionet.nsc.ruЧеренкоВ. А.CherenkoV. A.

Новосибирск

Novosibirsk

ФилипенкоЕ. А.FilipenkoE. A.

Новосибирск

Novosibirsk

ЖирновИ. В.ZhirnovI. V.

Новосибирск

Novosibirsk

ИвановА. А.IvanovA. A.

Новосибирск

Novosibirsk

https://orcid.org/0000-0003-3151-5181КочетовА. В.KochetovA. V.

Новосибирск

Novosibirsk

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Балтийский федеральный университет им. И. КантаРоссияInstitute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Immanuel Kant Baltic Federal UniversityRussian FederationФедеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наукРоссияInstitute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesRussian FederationФедеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университетРоссияInstitute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State UniversityRussian Federation20251101202629811691175Copyright © Голубева Т.С., Черенко В.А., Филипенко Е.А., Жирнов И.В., Иванов А.А., Кочетов А.В., 20262026Голубева Т.С., Черенко В.А., Филипенко Е.А., Жирнов И.В., Иванов А.А., Кочетов А.В.Golubeva T.S., Cherenko V.A., Filipenko E.A., Zhirnov I.V., Ivanov A.A., Kochetov A.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vavilov.elpub.ru/jour/article/view/4916

РНК-интерференция – мощный инструмент для генного сайленсинга, благодаря чему используется при разработке новых подходов с большим потенциалом для защиты растений от вирусов, насекомых и других патогенов. Как правило, в таких системах геном растений подвергается модификациям с целью синтеза двуцепочечных РНК (дцРНК), необходимых для РНК-интерференции и последующего сайленсинга непосредственно в растительных клетках. Однако с учетом законодательства Российской Федерации такой подход не может использоваться на сельскохозяйственных растениях, что делает невозможным его применение при условии синтеза дцРНК самим растением. Применение экзогенно синтезированной дцРНК может стать пер спективным способом защиты растений, так как позволяет избежать создания генетически модифицированных организмов и внедрить полученную разработку в сельском хозяйстве. Также экзогенные дцРНК имеют преимущество по сравнению с химикатами (фунгицидами, инсектицидами и т. д.), используемыми для защиты растений, так как дцРНК действуют посредством своей специфической нуклеотидной последовательности, что делает описанный подход крайне избирательным к патогену и безопасным для других организмов. В совокупности вышеперечисленные факторы делают методы РНК-интерференции весьма перспективными для применения в сельском хозяйстве с целью защиты растений, поэтому встает вопрос о крупномасштабном синтезе экзогенных молекул дцРНК, специфичных к определенному патогену, и выборе оптимального способа их доставки для достижения защитного эффекта. Целью настоящей работы является сайленсинг гена фитоендесатуразы табака Бентхама (Nicotiana benthamiana) с применением экзогенно синтезированной дцРНК. Ген фитоендесатуразы – очень удобная модель в экспериментах по регуляции генной активности, так как его сайленсинг сопровождается ярким фенотипическим проявлением в виде побеления листьев. Синтез дцРНК осуществляли in vivo в клетках Escherichia сoli; в качестве способа доставки выбрана корневая обработка через полив растения – максимально простые и доступные манипуляции. Предполагается, что предложенный подход может быть масштабирован и адаптирован для защиты растений в сельском хозяйстве с помощью методов, в основе которых лежит РНК-интерференция.

RNA interference (RNAi) is a powerful tool for gene silencing. It has recently been used to design promising plant protection strategies against pests such as viruses, insects, etc. This generally requires modifying the plant genome to achieve in planta synthesis of the double-stranded RNA (dsRNA), which guides the cellular RNA interference machinery to silence the genes of interest. However, given Russian legislation, the approach in which dsRNA is synthesized by the plant itself remains unavailable for crop protection. The use of exogenously produced dsRNA appears to be a promising alternative, allowing researchers to avoid genetic modification of plants, making it possible to implement potential results in agriculture. Furthermore, exogenous dsRNAs are superior to chemical pesticides (fungicides, insecticides, etc.), which are widely used to control various plant diseases. The dsRNA acts through sequence-specific nucleic acid interactions, making it extremely selective and unlikely to harm off-target organisms. Thus, it seems promising to utilize RNAi technology for agricultural plant protection. In this case, questions arise regarding how to produce the required amounts of pathogen-specific exogenous dsRNA, and which delivery method will be optimal for providing sufficient protection. This work aims to utilize exogenous dsRNA to silence the Nicotiana benthamiana phytoene desaturase gene. Phytoene desaturase is a convenient model gene in gene silencing experiments, as its knockdown results in a distinct phenotypic manifestation, namely, leaf bleaching. The dsRNA synthesis for this work was performed in vivo in Escherichia coli cells, and the chosen delivery method was root treatment through watering, both techniques being as simple and accessible as possible. It is surmised that the proposed approach could be adapted for broader use of RNAi technologies in agricultural crop protection.

РНК-интерференциягенный сайленсингфитоендесатуразаэкзогенная дцРНКNicotiana benthamianaкорневая обработкаRNA interferencegene silencingphytoene desaturaseexogenous dsRNANicotiana benthamianaroot treatmentThe research was carried out within the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation FWNR-2022-0017The research was carried out within the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation FWNR-2022-0017ReferencesBrigneti G., Martín-Hernández A.M., Jin H., Chen J., Baulcombe D.C., Baker B., Jones J.D.G. Virus-induced gene silencing in Solanum species. Plant J. 2004;39(2):264-272. doi 10.1111/J.1365-313X.2004.02122.xBrigneti G., Martín-Hernández A.M., Jin H., Chen J., Baulcombe D.C., Baker B., Jones J.D.G. Virus-induced gene silencing in Solanum species. Plant J. 2004;39(2):264-272. doi 10.1111/J.1365-313X.2004.02122.xBurch-Smith T.M., Schiff M., Liu Y., Dinesh-Kumar S.P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 2006; 142(1):21-27. doi 10.1104/pp.106.084624Burch-Smith T.M., Schiff M., Liu Y., Dinesh-Kumar S.P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 2006; 142(1):21-27. doi 10.1104/pp.106.084624Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 2009;136(4):642-655. doi 10.1016/j.cell.2009.01.035Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 2009;136(4):642-655. doi 10.1016/j.cell.2009.01.035Dubrovina A.S., Kiselev K.V. Exogenous RNAs for gene regulation and plant resistance. Int J Mol Sci. 2019;20(9):2282. doi 10.3390/ijms20092282Dubrovina A.S., Kiselev K.V. Exogenous RNAs for gene regulation and plant resistance. Int J Mol Sci. 2019;20(9):2282. doi 10.3390/ijms20092282Gan D., Zhang J., Jiang H., Jiang T., Zhu S., Cheng B. Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection. Plant Cell Rep. 2010;29(11):1261-1268. doi 10.1007/s00299-010-0911-zGan D., Zhang J., Jiang H., Jiang T., Zhu S., Cheng B. Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection. Plant Cell Rep. 2010;29(11):1261-1268. doi 10.1007/s00299-010-0911-zJiang L., Ding L., He B., Shen J., Xu Z., Yin M., Zhang X. Systemic gene silencing in plants triggered by fluorescent nanoparticledelivered double-stranded RNA. Nanoscale. 2014;6(17):9965-9969. doi 10.1039/c4nr03481cJiang L., Ding L., He B., Shen J., Xu Z., Yin M., Zhang X. Systemic gene silencing in plants triggered by fluorescent nanoparticledelivered double-stranded RNA. Nanoscale. 2014;6(17):9965-9969. doi 10.1039/c4nr03481cKamthan A., Chaudhuri A., Kamthan M., Datta A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Front Plant Sci. 2015;6(APR). doi 10.3389/FPLS.2015.00208/PDFKamthan A., Chaudhuri A., Kamthan M., Datta A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Front Plant Sci. 2015;6(APR). doi 10.3389/FPLS.2015.00208/PDFKoch A., Biedenkopf D., Furch A., Weber L., Rossbach O., Abdel latef E., Linicus L., Johannsmeier J., Jelonek L., Goesmann A., Cardoza V., McMillan J., Mentzel T., Kogel K.H. An RNAi-based control of Fusarium graminearum infections through spraying of long dsRNAs involves a plant passage and is controlled by the fun gal silencing machinery. PLoS Pathog. 2016;12(10):e1005901. doi 10.1371/journal.ppat.1005901Koch A., Biedenkopf D., Furch A., Weber L., Rossbach O., Abdel latef E., Linicus L., Johannsmeier J., Jelonek L., Goesmann A., Cardoza V., McMillan J., Mentzel T., Kogel K.H. An RNAi-based control of Fusarium graminearum infections through spraying of long dsRNAs involves a plant passage and is controlled by the fun gal silencing machinery. PLoS Pathog. 2016;12(10):e1005901. doi 10.1371/journal.ppat.1005901Laurila M.R.L., Makeyev E.V., Bamford D.H. Bacteriophage φ6 RNA dependent RNA polymerase. Molecular details of initiating nucleic acid synthesis without primer. J Biol Chem. 2002;277(19):17117 17124. doi 10.1074/jbc.M111220200Laurila M.R.L., Makeyev E.V., Bamford D.H. Bacteriophage φ6 RNA dependent RNA polymerase. Molecular details of initiating nucleic acid synthesis without primer. J Biol Chem. 2002;277(19):17117 17124. doi 10.1074/jbc.M111220200Li H., Guan R., Guo H., Miao X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant Cell Environ. 2015;38(11):2277-2285. doi 10.1111/pce.12546Li H., Guan R., Guo H., Miao X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant Cell Environ. 2015;38(11):2277-2285. doi 10.1111/pce.12546Liu Y., Schiff M., Marathe R., Dinesh-Kumar S.P. Tobacco Rar1, EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated re sistance to tobacco mosaic virus. Plant J. 2002;30(4):415-429. doi 10.1046/J.1365-313x.2002.01297.xLiu Y., Schiff M., Marathe R., Dinesh-Kumar S.P. Tobacco Rar1, EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated re sistance to tobacco mosaic virus. Plant J. 2002;30(4):415-429. doi 10.1046/J.1365-313x.2002.01297.xMitter N., Worrall E.A., Robinson K.E., Li P., Jain R.G., Taochy C., Fletcher S.J., Carroll B.J., Lu G.Q., Xu Z.P. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant vi ruses. Nat Plants. 2017;3:16207. doi 10.1038/nplants.2016.207Mitter N., Worrall E.A., Robinson K.E., Li P., Jain R.G., Taochy C., Fletcher S.J., Carroll B.J., Lu G.Q., Xu Z.P. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant vi ruses. Nat Plants. 2017;3:16207. doi 10.1038/nplants.2016.207Niehl A., Soininen M., Poranen M.M., Heinlein M. Synthetic biology approach for plant protection using dsRNA. Plant Biotechnol J. 2018;16(9):1679-1687. doi 10.1111/pbi.12904Niehl A., Soininen M., Poranen M.M., Heinlein M. Synthetic biology approach for plant protection using dsRNA. Plant Biotechnol J. 2018;16(9):1679-1687. doi 10.1111/pbi.12904Nishimura A., Morita M., Nishimura Y., Sugino Y. A rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acids Res. 1990;18(20):6169. doi 10.1093/nar/18.20.6169Nishimura A., Morita M., Nishimura Y., Sugino Y. A rapid and highly efficient method for preparation of competent Escherichia coli cells. Nucleic Acids Res. 1990;18(20):6169. doi 10.1093/nar/18.20.6169Numata K., Ohtani M., Yoshizumi T., Demura T., Kodama Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol J. 2014;12(8):1027-1034. doi 10.1111/pbi.12208Numata K., Ohtani M., Yoshizumi T., Demura T., Kodama Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol J. 2014;12(8):1027-1034. doi 10.1111/pbi.12208Ratcliff F., Martin-Hernandez A.M., Baulcombe D.C. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J. 2001;25(2):237-245. doi 10.1046/J.0960-7412.2000.00942.xRatcliff F., Martin-Hernandez A.M., Baulcombe D.C. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J. 2001;25(2):237-245. doi 10.1046/J.0960-7412.2000.00942.xTenllado F., Martínez-García B., Vargas M., Díaz-Ruíz J.R. Crude ex tracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003;3:3. doi 10.1186/1472-6750-3-3Tenllado F., Martínez-García B., Vargas M., Díaz-Ruíz J.R. Crude ex tracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003;3:3. doi 10.1186/1472-6750-3-3Tiwari I.M., Jesuraj A., Kamboj R., Devanna B.N., Botella J.R., Shar ma T.R. Host Delivered RNAi, an efficient approach to increase rice resistance to sheath blight pathogen (Rhizoctonia solani). Sci Rep. 2017;7(1):1-14. doi 10.1038/S41598-017-07749Tiwari I.M., Jesuraj A., Kamboj R., Devanna B.N., Botella J.R., Shar ma T.R. Host Delivered RNAi, an efficient approach to increase rice resistance to sheath blight pathogen (Rhizoctonia solani). Sci Rep. 2017;7(1):1-14. doi 10.1038/S41598-017-07749Wang J., Gu L., Knipple D.C. Evaluation of some potential target genes and methods for RNAi-mediated pest control of the corn earworm Helicoverpa zea. Pestic Biochem Physiol. 2018;149:67-72. doi 10.1016/j.pestbp.2018.05.012Wang J., Gu L., Knipple D.C. Evaluation of some potential target genes and methods for RNAi-mediated pest control of the corn earworm Helicoverpa zea. Pestic Biochem Physiol. 2018;149:67-72. doi 10.1016/j.pestbp.2018.05.012

The authors declare that there are no conflicts of interest present.