Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток американской норки: протокол

Возможность репрограммирования генома млекопитающих активно исследуется более полувека. В 1962 г. Гёрдон впервые показал возможность репрограммирования генома дифференцированной клетки факторами энуклеированного ооцита. В 2006 г. Яманака получил индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) мыши из фибробластов с помощью всего лишь четырех транскрипционных факторов: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc. Получение ИПСК поставило вопрос о полноте репрограммирования: остаются ли активными гены, экспрессирующиеся в исходных фибробластах?
И насколько характеристики ИПСК соответствует эмбриональным стволовым (ЭС) клеткам, которые в данном случае являются стандартом. В настоящее время ИПСК получены для десятков видов животных, однако ЭС клетки – менее чем для двадцати. В 1993 г. в Институте цитологии и генетики СО РАН были получены ЭС клетки ценного пушного зверя – американской норки (Neovison vison), благодаря чему появилась уникальная возможность сравнить индуцированные и полученные из эмбриона плюрипотентные клетки. В 2015 г. нами получены ИПСК американской норки и показано репрограммирование генома фибробластов на уровне анализа экспрессии генов: часть генов была успешно репрограммирована, часть имела промежуточную между фибробластами и ЭС  клетками экспрессию, часть не репрограммировалась, и наконец, присутствовали гены, экспрессия которых отличалась от обоих типов клеток. Таким образом, еще для одного вида животных стало возможным изучать плюрипотентность и дифференцировку на двух типах плюрипотентных клеток: ЭС и ИПСК. В настоящей статье представлен подробный протокол получения ИПСК американской норки с использованием векторов, несущих гены OCT4, KLF4, SOX2 и c­MYC человека. Кратко описан необходимый набор методов анализа: морфология ИПСК, цитогенетический анализ, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией на присутствие «маркирующих» плюрипотентность генов и тест на формирование тератом в иммунодефицитных мышах. Данный протокол позволяет воспроизводимо и эффективно получать ИПСК из фибробластов американской норки.

1. Baird A., Barsby T., Guest D.J. Derivation of canine induced pluripo-tent stem cells. Reprod. Domest. Anim. 2015;50(4):669-676. DOI 10.1111/rda.12562.

2. Buta C., David R., Dressel R., Emgård M., Fuchs C., Gross U., Healy L., Hescheler J., Kolar R., Martin U., Mikkers H., Müller F.J., Schneider R.K., Seiler A.E., Spielmann H., Weitzer G. Reconsidering pluripotency tests: do we still need teratoma assays? Stem Cell Res. 2013;11(1):552-562. DOI 10.1016/j.scr.2013.03.001.

3. Hentze H., Soong P.L., Wang S.T., Phillips B.W., Putti T.C., Dunn N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2009; 2(3):198-210. DOI 10.1016/j.scr.2009.02.002.

4. Hogan B., Beddington R., Costantini F., Lacy L. Manipulating the Mouse Embryo. 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

5. Kizilova E.A. Optimization of the teratoma formation test. Geny i kletki = Genes & Cells. 2016;11(2):119-128. (in Russian)

6. Mandahl N., Fredga K. Q-, G- and C-band patterns of the mink chromosomes. Hereditas. 1975;81(2):211-220.

7. Mathew R., Jia W., Sharma A., Zhao Y., Clarke L.E., Cheng X., Wang H., Salli U., Vrana K.E., Robertson G.P., Zhu J., Wang S. Robust activation of the human but not mouse telomerase gene during the induction of pluripotency. FASEB J. 2010;24(8):2702-2715. DOI 10.1096/fj.09-148973.

8. Menzorov A.G., Matveeva N.M., Markakis M.N., Fishman V.S., Christensen K., Khabarova A.A., Pristyazhnyuk I.E., Kizilova E.A., Cirera S., Anistoroaei R., Serov O.L. Comparison of American mink embryonic stem and induced pluripotent stem cell transcriptomes. BMC Genomics. 2015;16(Suppl. 13):S6. DOI 10.1186/1471-2164- 16-S13-S6.

9. Rouvinen-Watt K., Harris L., Dick M., Pal C., Lei S., Mustonen A.M., Nieminen P. Role of hepatic de novo lipogenesis in the development of fasting-induced fatty liver in the American mink (Neovison vison). Br. J. Nutr. 2012;108(8):1360-1370. DOI 10.1017/ S0007114511006775.

10. Sukoyan M.A., Vatolin S.Y., Golubitsa A.N., Zhelezova A.I., Semenova L.A., Serov O.L. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass, and blastocysts of mink: comparisons of their pluripotencies. Mol. Reprod. Dev. 1993;36(2):148-158. DOI 10.1002/ mrd.1080360205.

11. Takahashi K., Okita K., Nakagawa M., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2007;2(12): 3081-3089. DOI 10.1038/nprot.2007.418.

12. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024.

13. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., Jonsdottir G.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007;318(5858):1917-1920. DOI 10.1126/science.1151526.