Манипуляции с ранними эмбрионами мыши для создания генетически модифицированных животных

За последнее время технологии редактирования генома стали более эффективными и доступными. Открытие нуклеаз для направленного редактирования геномов (CRISPR/Cas9, TALEN, ZFNs) значительно ускорило и упростило получение мышей с адресными направленными изменениями в геноме. В настоящее время наиболее популярной системой является CRISPR/Cas9 благодаря своей простоте и высокой эффективности. Технологию CRISPR/ Cas9 эффективно используют для «нокаутирования» генов, получения масштабных делеций или направленных инсерций в целевых участках генома на эмбриональных стволовых клетках (ЭСК). Такие генетически модифицированные ЭСК после инъекции их в полость бластоцист способны генерировать развитие и рождение химерных животных, у которых часть гамет имеет идентичный генотип ЭСК. Таким образом, среди потомства химерных животных рождаются мыши с модифицированными геномами. Недавно технология CRISPR/Cas9 была успешно применена на зиготах, что существенно сократило время получения животных с необходимыми генетическими модификациями. Несмотря на то что современные технологии редактирования генома упрощают получение генно-модифицированных животных, данная технология остается сложной в воспроизведении и имеет множество тонкостей из-за методов и техник работы с ранними эмбрионами. Вследствие этого для исследователя, работающего в области получения генномодифицированных животных, важно использование современных технологий и совершенное владение эмбриологическими техниками. В настоящей статье описаны протоколы микроинъекции в пронуклеус или цитоплазму зигот, подготовка растворов для микроинъекции, а также методы инъекции ЭСК в полость бластоцисты. Помимо этого, приведены протоколы для работы с мышами, а именно: суперовуляция и подготовка гормонов, получение эмбрионов на ранних стадиях (зиготы и бластоцисты), подготовка вазектомированных самцов и суррогатных матерей, трансплантация эмбрионов в яйцевод или матку. Отдельно приводится сборка и необходимые составляющие наркозного аппарата для изофлуранового наркоза и проведение общей анастезии.

трансгенез, инъекция в зиготу, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), инъекция ЭСК в бластоцисту, трансплантация эмбрионов

1. Boroviak K., Doe B., Banerjee R., Yang F., Bradley A. Chromosome engineering in zygotes with CRISPR/Cas9. Genesis. 2016;54(2): 78­85. DOI 10.1002/dvg.22915.

2. Bradley A., Evans M., Kaufman M.H., Robertson E. Formation of germ­line chimaeras from embryo­derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 1984;309(5965):255­256.

3. Brinster R.L., Braun R.E., Lo D., Avarbock M.R., Oram F., Palmiter R.D. Targeted correction of a major histocompatibility class II E alpha gene by DNA microinjected into mouse eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989;86(18):7087­7091.

4. Capecchi M. Altering the genome by homologous recombination. Science. 1989;244(4910):1288­1292.

5. Carbery I.D., Ji D., Harrington A., Brown V., Weinstein E.J., Liaw L., Cui X. Targeted genome modification in mice using zinc­finger nucleases. Genetics. 2010;186(2):451­459. DOI 10.1534/genetics.110.117002.

6. Chu V.T., Weber T., Graf R., Sommermann T., Petsch K., Sack U., Volchkov P., Rajewsky K., Kühn R. Efficient generation of Rosa26 knock­in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 2016;16(1):4. DOI 10.1186/s12896­016­0234­4.

7. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.A., Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013;339(6121):819823. DOI 10.1126/science.1231143.

8. Dupont C., Loos F., Kong­A­San J., Gribnau J. FGF treatment of host embryos injected with ES cells increases rates of chimaerism. Transgenic Res. 2017;26(2):237­246. DOI 10.1007/s11248­016­9997­6.

9. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981;292(5819):154­156. DOI 10.1038/292154a0.

10. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980;77(12):7380­7384.

11. Kawase Y., Iwata T., Watanabe M., Kamada N., Ueda O., Suzuki H. Application of the piezo­micromanipulator for injection of embryonic stem cells into mouse blastocysts. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 2001;40(2):31­34.

12. Kraft K., Geuer S., Will A.J., Chan W.L., Paliou C., Borschiwer M., Harabula I., Wittler L., Franke M., Ibrahim D.M., Kragesteen B.K., Spielmann M., Mundlos S., Lupiáñez D.G., Andrey G. Deletions, inversions, duplications: engineering of structural variants using CRISPR/Cas in mice. Cell Rep. 2015;10(5):833­839. DOI 10.1016/j.celrep.2015.01.016.

13. Lin F.L., Sperle K., Sternberg N. Recombination in mouse L cells between DNA introduced into cells and homologous chromosomal sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985;82(5):1391­1395.

14. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. RNA­guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121):823­826. DOI 10.1126/science.1232033.

15. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981;78(12):7634­7638.

16. Raveux A., Vandormael­Pournin S., Cohen­Tannoudji M. Optimization of the production of knock­in alleles by CRISPR/Cas9 microinjection into the mouse zygote. Sci. Rep. 2017;7:42661. DOI 10.1038/srep42661.

17. Smithies O., Gregg R.G., Boggs S.S., Koralewski M.A., Kucherlapati R.S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta­globin locus by homologous recombination. Nature. 1985; 317(6034):230­234.

18. Sung Y.H., Baek I.J., Kim D.H., Jeon J., Lee J., Lee K., Jeong D., Kim J.S., Lee H.W. Knockout mice created by TALEN­mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 2013;31(1):23­24. DOI 10.1038/nbt.2477.

19. Wang Z., Jaenisch R. At most three ES cells contribute to the somatic lineages of chimeric mice and of mice produced by ES­tetraploid complementation. Dev. Biol. 2004;275(1):192­201. DOI 10.1016/j.ydbio.2004.06.026.

20. Yang H., Wang H., Jaenisch R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas­mediated genome engineering. Nat. Protoc. 2014; 9(8):1956­1968. DOI 10.1038/nprot.2014.134.