Использование вектора на основе вируса Сендай для эффективной трансдукции фибробластов ластоногих

Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) млекопитающих расширило возможности изучения плюрипотентности и раннего эмбрионального развития. В литературе описаны ИПСК собаки (Canis lupus familiaris) и снежного леопарда (Panthera uncia), представителей отряда Carnivora. Ранее нами получены ИПСК американской норки (Neovison vison). Целью настоящего исследования был поиск условий для репрограммирования фибробластов ластоногих – представителей каноидной (Caniformia) ветви Хищных с консервативными геномами. Для создания ИПСК можно использовать различные системы доставки репрограммирующих транскрипционных факторов (РНК, белки, плазмиды, векторы на основе вирусов и др.). Наиболее эффективные системы доставки для клеток мыши и человека основаны на применении различных вирусных векторов. Мы сравнили две системы доставки репрограммирующих факторов: встраивающиеся в геном лентивирусные векторы и вектор на основе вируса Сендай – CytoTune EmGFP Sendai Fluorescence Reporter. Преимущества векторов на основе вируса Сендай по сравнению с лентивирусами – отсутствие встройки в геном. Проведено тестирование доставки генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный белок, на культурах фибробластов семи видов ластоногих: северного морского котика (Callorhinus ursinus), северного морского льва (Eumetopias jubatus), моржа (Odobenus rosmarus), морского зайца (Erignathus barbatus), байкальской нерпы (Pusa sibirica), кольчатой нерпы (Phoca hispida) и пестрой нерпы (Phoca largha). В качестве контроля были трансдуцированы фибробласты американской норки (N. vison), человека (Homo sapiens) и мыши (Mus musculus). Мы показали, что система трансдукции на основе вируса Сендай обеспечивает уровень экспрессии трансгена на один­два порядка выше, чем при использовании лентивирусов при сходном числе вирусов на клетку. Кроме того, экспрессия трансгена при применении вектора на основе вируса Сендай достаточно стабильна и незначительно изменяется на четвертый день трансдукции по сравнению со вторым днем. Полученные данные позволяют предположить, что трансдукция фибробластов ластоногих с помощью вируса Сендай предпочтительна для получения ИПСК ластоногих.

1. Борода А.В., Питерсон С.Е., Монтэгю С.К., Пиварофф К.Дж., Штейн Дж., Ли Ч.Я., Лорин Дж.Ф., Одинцова Н.А. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из замороженных в жидком азоте биоптатов кожи байкальской нерпы (Pusa sibirica) и сивуча (Eumetopias jubatus). Морские млекопитающие Голарктики. Сб. науч. тр. по матер. VIII междунар. конф. Санкт-Петербург, 22-27 сентября 2014 г. М., 2015;1:73-77.

2. Пристяжнюк И.Е., Мензоров А.Г. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток американской норки: протокол. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(6):701- 709. DOI 10.18699/VJ17.288.

3. Baird A., Barsby T., Guest D.J. Derivation of canine induced pluripotent stem cells. Reprod. Domest. Anim. 2015;50(4):669-676. DOI 10.1111/rda.12562.

4. Ban H., Nishishita N., Fusaki N., Tabata T., Saeki K., Shikamura M., Takada N., Inoue M., Hasegawa M., Kawamata S., Nishikawa S. Effcient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011;108(34):14234-14239. DOI 10.1073/pnas.1103509108.

5. Coppiello G., Abizanda G., Aguado N., Iglesias E., Arellano-Viera E., Rodriguez-Madoz J.R., Carvajal-Vergara X., Prosper F., Aranguren X.L. Generation of Macaca fascicularis iPS cell line ATCiMF1 from adult skin fbroblasts using non-integrative Sendai viruses. Stem Cell Res. 2017;21:1-4. DOI 10.1016/j.scr.2017.03.008.

6. Cronin J., Zhang X.Y., Reiser J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr. Gene Ther. 2005;5(4):387-398.

7. Cubitt A.B., Woollenweber L.A., Heim R. Understanding structurefunction relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. Met. Cell Biol. 1999;58:19-30.

8. Fujie Y., Fusaki N., Katayama T., Hamasaki M., Soejima Y., Soga M., Ban H., Hasegawa M., Yamashita S., Kimura S., Suzuki S., Matsuzawa T., Akari H., Era T. New type of Sendai virus vector provides transgene-free iPS cells derived from chimpanzee blood. PLoS One. 2014;9(12):e113052. DOI 10.1371/journal.pone.0113052.

9. Fusaki N., Ban H., Nishiyama A., Saeki K., Hasegawa M. Effcient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 2009; 85(8):348-362.

10. Galat V., Galat Y., Perepitchka M., Jennings L.J., Iannaccone P.M., Hendrix M.J. Transgene reactivation in induced pluripotent stem cell derivatives and reversion to pluripotency of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2016; 25(14):1060-1072. DOI 10.1089/scd.2015.0366.

11. Karwacki-Neisius V., Göke J., Osorno R., Halbritter F., Ng J.H., Weiße A.Y., Wong F.C., Gagliardi A., Mullin N.P., Festuccia N., Colby D., Tomlinson S.R., Ng H.H., Chambers I. Reduced Oct4 expression directs a robust pluripotent state with distinct signaling activity and increased enhancer occupancy by Oct4 and Nanog. Cell Stem Cell. 2013;12(5):531-545. DOI 10.1016/j.stem.2013.04.023.

12. Koh S., Thomas R., Tsai S., Bischoff S., Lim J.-H., Breen M., Olby N.J., Piedrahita J.A. Growth requirements and chromosomal instability of induced pluripotent stem cells (iPSC) generated from adult canine fbroblasts. Stem Cells Dev. 2012;22(6):951-963. DOI 10.1089/scd.2012.0393.

13. Lee A.S., Xu D., Plews J.R., Nguyen P.K., Nag D., Lyons J.K., Han L., Hu S., Lan F., Liu J., Huang M., Narsinh K.H., Long C.T., de Almeida P.E., Levi B., Kooreman N., Bangs C., Pacharinsak C., Ikeno F., Yeung A.C., Gambhir S.S., Robbins R.C., Longaker M.T., Wu J.C. Preclinical derivation and imaging of autologously transplanted canine induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2011; 286(37):32697-32704. DOI 10.1074/jbc.M111.235739.

14. Li H.O., Zhu Y.F., Asakawa M., Kuma H., Hirata T., Ueda Y., Lee Y.S., Fukumura M., Iida A., Kato A., Nagai Y., Hasegawa M. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with effcient gene transfer and expression. J. Virol. 2000;74(14):6564- 6569.

15. Lu J., Liu H., Huang C.T., Chen H., Du Z., Liu Y., Sherafat M.A., Zhang S.C. Generation of integration¬free and region-specifc neural progenitors from primate fbroblasts. Cell Rep. 2013;3(5):1580- 1591. DOI 10.1016/j.celrep.2013.04.004.

16. Luo J., Suhr S.T., Chang E.A., Wang K., Ross P.J., Nelson L.L., Venta P.J., Knott J.G., Cibelli J.B. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fbroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 2011;20(10):1669-1678. DOI 10.1089/scd.2011.0127.

17. Maherali N., Sridharan R., Xie W., Utikal J., Eminli S., Arnold K., Stadtfeld M., Yachechko R., Tchieu J., Jaenisch R., Plath K., Hochedlinger K. Directly reprogrammed fbroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 2007;1(1):55-70. DOI 10.1016/j.stem.2007.05.014.

18. Menzorov A.G., Matveeva N.M., Markakis M.N., Fishman V.S., Christensen K., Khabarova A.A., Pristyazhnyuk I.E., Kizilova E.A., Cirera S., Anistoroaei R., Serov O.L. Comparison of American mink embryonic stem and induced pluripotent stem cell transcriptomes. BMC Genomics. 2015;16(Suppl. 13):S6. DOI 10.1186/1471-2164-16-S13-S6.

19. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defnes differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 2000;24(4):372-376. DOI 10.1038/74199.

20. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007;448:313-317. DOI 10.1038/nature05934.

21. Shimada H., Nakada A., Hashimoto Y., Shigeno K., Shionoya Y., Nakamura T. Generation of canine induced pluripotent stem cells by retroviral transduction and chemical inhibitors. Mol. Reprod. Dev. 2010;77(1):2. DOI 10.1002/mrd.21117.

22. Takahashi K., Okita K., Nakagawa M., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from fbroblast cultures. Nat. Protoc. 2007;2(12): 3081-3089. DOI 10.1038/nprot.2007.418.

23. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fbroblast cultures by defned factors. Cell. 2006;126(4):663-676. DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024.

24. Tsukamoto M., Nishimura T., Yodoe K., Kanegi R., Tsujimoto Y., Alam M.E., Kuramochi M., Kuwamura M., Ohtaka M., Nishimura K., Nakanishi M., Inaba T., Sugiura K., Hatoya S. Generation of footprint-free canine induced pluripotent stem cells using auto-erasable Sendai virus vector. Stem Cells Dev. 2018;27(22):1577-1586. [Epub ahead of print]. DOI 10.1089/scd.2018.0084.

25. Tucker B.A., Anfnson K.R., Mullins R.F., Stone E.M., Young M.J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl. Med. 2013;2(1):16-24. DOI 10.5966/sctm.2012-0040.

26. Verma R., Holland M.K., Temple-Smith P., Verma P.J. Inducing pluripotency in somatic cells from the snow leopard (Panthera uncia), an endangered felid. Theriogenology. 2012;77(1):220-228, 228.e221- 222. DOI 10.1016/j.theriogenology.2011.09.022.

27. Wernig M., Meissner A., Foreman R., Brambrink T., Ku M., Hochedlinger K., Bernstein B.E., Jaenisch R. In vitro reprogramming of fbroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 2007;448: 318-324. DOI 10.1038/nature05944.

28. Whitworth D.J., Ovchinnikov D.A., Wolvetang E.J. Generation and Characterization of LIF-dependent canine induced pluripotent stem cells from adult dermal Fibroblasts. Stem Cells Dev. 2012;21(12): 2288-2297. DOI 10.1089/scd.2011.0608.

29. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J., Jonsdottir G.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007;318(5858):1917- 1920. DOI 10.1126/science.1151526.