Способы повышения эффективности knock-in в геном плюрипотентных клеток человека при помощи системы CRISPR/Cas9

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (чИПСК) – мощный инструмент для биомедицинских исследований. Возможность создания пациент-специфичных плюрипотентных клеток и последующая их дифференцировка в любой тип соматических клеток делают чИПСК замечательным объектом для создания in vitro моделей заболеваний, скрининга лекарственных препаратов и будущим источником клеточного материала для регенеративной медицины. Для того чтобы потенциал технологии чИПСК можно было реализовать в полном объеме, необходимы эффективные и точные методы редактирования генома этих клеток. В настоящее время система CRISPR/Cas9 – наиболее широко используемый подход для введения в ДНК сайт-специфичных двуцепочечных разрывов. С ее помощью с высокой эффективностью удается реализовать knock-out интересующих исследователя генов. Однако введение в целевое место генома заданной последовательности (knock-in) является существенно более сложной задачей. В зависимости от выбранного для проведения встройки локуса эффективность knock-in в геном чИПСК может составлять от 1 × 10–5 до 1 × 10–6, что на порядок ниже, чем показано для эмбриональных стволовых клеток мышей или перевивных линий клеток. В этом обзоре я делаю попытку объединить и структурировать всю известную информацию, касающуюся увеличения эффективности получения целевых встроек в геном чИПСК. В статье перечислены наиболее эффективные стратегии разработки донора для гомологичной рекомбинации, способы управления путями восстановления двуцепочечных разрывов, внесенных нуклеазой, в том числе за счет управления временем работы системы CRISPR/Cas9 в клетке. Низкая выживаемость чИПСК в результате проведения экспериментов по редактированию генома – еще одно затруднение на пути к успешному получению knock-in, для устранения которого предложено несколько высокоэффективных подходов. Наконец, я описываю, на мой взгляд, наиболее многообещающую стратегию получения линий чИПСК с целевой встройкой, которой является одновременное проведение редактирования и репрограммирования генома.

индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, система CRISPR/Cas9, редактирование генома, эффективность knock-in

1. Редактирование генов и геномов. Отв. ред. С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, Е.А. Покушалов, В.В. Власов. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2018.

2. Смирнов А.В., Юнусова А.М., Лукьянчикова В.А., Баттулин Н.Р. Система CRISPR/Cas9 – универсальный инструмент геномной инженерии. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016; 20(4):493-510. DOI 10.18699/VJ16.175.

3. Anand R., Ranjha L., Cannavo E., Cejka P. Phosphorylated CtIP functions as a co-factor of the MRE11-RAD50-NBS1 endonuclease in DNA end resection. Mol. Cell. 2016;64:940-950.

4. Bothmer A., Phadke T., Barrera L.A., Margulies C.M., Lee C.S., Buquicchio F., Moss S., Abdulkerim H.S., Selleck W., Jayaram H., Myer V.E., Cotta-Ramusino C. Characterization of the interplay between DNA repair and CRISPR/Cas9-induced DNA lesions at an endogenous locus. Nat. Commun. 2017;8:13905. DOI 10.1038/ncomms13905.

5. Charpentier M., Khedher A.H.Y., Menoret S., Brion A., Lamribet K., Dardillac E., Boix C., Perrouault L., Tesson L., Geny S., De Cian A., Itier J.M., Anegon I., Lopez B., Giovannangeli C., Concordet J.P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homologydependent repair. Nat. Commun. 2018;9(1):1133. DOI 10.1038/s41467-018-03475-7.

6. Chen F., Pruett-Miller S.M., Huang Y., Gjoka M., Duda K., Taunton J., Collingwood T.N., Frodin M., Davis G.D. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-fnger nucleases. Nat. Methods. 2011;8(9):753-755. DOI 10.1038/nmeth.1653.

7. Chen X., Janssen J.M., Liu J., Maggio I., ‘t Jong A.E.J., Mikkers H.M.M., Gonçalves M.A.F.V. In trans paired nicking triggers seamless genome editing without double-stranded DNA cutting. Nat. Commun. 2017;8(1):657. DOI 10.1038/s41467-017-00687-1.

8. Chu V.T., Weber T., Wefers B., Wurst W., Sander S., Rajewsky K., Kühn R. Increasing the effciency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 2015;33(5):543-548. DOI 10.1038/nbt.3198.

9. Dexheimer T. DNA repair pathways and mechanisms. Eds. L. Mathews, S. Cabarcas, E. Hurt. DNA Repair of Cancer Stem Cells. Dordrecht: Springer, 2013;19-32.

10. Doyon Y., Choi V.M., Xia D.F., Vo T.D., Gregory P.D., Holmes M.C. Transient cold shock enhances zinc-fnger nuclease-mediated gene disruption. Nat. Meth. 2010;7:459-460. DOI 10.1038/nmeth.1456.

11. Dumitru R., Gama V., Fagan B.M., Bower J.J., Swahari V., Pevny L.H., Deshmukh M. Human embryonic stem cells have constitutively active Bax at the Golgi and are primed to undergo rapid apoptosis. Mol. Cell. 2012;46(5):573-583. DOI 10.1016/j.molcel.2012.04.002.

12. Guo Q., Mintier G., Ma¬Edmonds M., Storton D., Wang X., Xiao X., Kienzle B., Zhao D., Feder J.N. ‘Cold shock’ increases the frequency of homology directed repair gene diting in induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 2018;8(1):2080. DOI 10.1038/s41598-018-20358-5.

13. Haber J.E. DNA repair: the search for homology. Bioessays. 2018; 40(5):e1700229. DOI 10.1002/bies.201700229.

14. Heyer W.D., Ehmsen K.T., Liu J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 2010;44:113-139.

15. Howden S.E., McColl B., Glaser A., Vadolas J., Petrou S., Little M.H., Elefanty A.G., Stanley E.G. A Cas9 variant for effcient generation of indel-free Knockin or gene-corrected human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2016;7(3):508-517. DOI 10.1016/j.stemcr.2016.07.001.

16. Hsu P.D., Lander E.S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014;157:1262-1278. DOI 10.1016/j.cell.2014.05.010.

17. Ihry R.J., Worringer K.A., Salick M.R., Frias E., Ho D., Theriault K., Kommineni S., Chen J., Sondey M., Ye C., Randhawa R., Kulkarni T., Yang Z., McAllister G., Russ C., Reece-Hoyes J., Forrester W., Hoffman G.R., Dolmetsch R., Kaykas A. p53 inhibits CRISPRCas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat. Med. 2018; 24(7):939-946. DOI 10.1038/s41591-018-0050-6.

18. Kim S., Kim D., Cho S.W., Kim J., Kim J.S. Highly effcient RNAguided genome editing in human cells via delivery of purifed Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24:1012-1019. DOI 10.1101/gr.171322.113.

19. Li X.L., Li G.H., Fu J., Fu Y.W., Zhang L., Chen W., Arakaki C., Zhang J.P., Wen W., Zhao M., Chen W.V., Botimer G.D., Baylink D., Aranda L., Choi H., Bechar R., Talbot P., Sun C.K., Cheng T., Zhang X.B. Highly effcient genome editing via CRISPR-Cas9 in human pluripotent stem cells is achieved by transient BCL-XL overexpression. Nucleic Acids Res. 2018. DOI 10.1093/nar/gky804.

20. Liang X., Potter J., Kumar S., Ravinder N., Chesnut J.D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J. Biotechnol. 2017;241:136-146. DOI 10.1016/j.jbiotec.2016.11.011.

21. Liang X., Potter J., Kumar S., Zou Y., Quintanilla R., Sridharan M., Carte J., Chen W., Roark N., Ranganathan S., Ravinder N., Chesnut J.D. Rapid and highly effcient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 2015;208:44-53. DOI 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024.

22. Lin S., Staahl B.T., Alla R.K., Doudna J.A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/ Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. DOI 10.7554/eLife.04766.

23. Liu J.C., Guan X., Ryan J.A., Rivera A.G., Mock C., Agrawal V., Letai A., Lerou P.H., Lahav G. High mitochondrial priming sensitizes hESCs to DNA-damage-induced apoptosis. Cell Stem Cell. 2013; 13(4):483-491. DOI 10.1016/j.stem.2013.07.018.

24. Liu J.C., Lerou P.H., Lahav G. Stem cells: balancing resistance and sensitivity to DNA damage. Trends Cell. Biol. 2014;24:268-274. DOI 10.1016/j.tcb.2014.03.002.

25. Ma X., Chen X., Jin Y., Ge W., Wang W., Kong L., Ji J., Guo X., Huang J., Feng X.H., Fu J., Zhu S. Small molecules promote CRISPRCpf1-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Nat. Commun. 2018;9(1):1303. DOI 10.1038/s41467-018-03760-5.

26. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121):823-826. DOI 10.1126/science.1232033.

27. Maruyama T., Dougan S.K., Truttmann M.C., Bilate A.M., Ingram J.R., Ploegh H.L. Increasing the effciency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat. Biotechnol. 2015;33(5):538-542. DOI 10.1038/nbt.3190.

28. Merkle F.T., Neuhausser W.M., Santos D., Valen E., Gagnon J.A., Maas K., Sandoe J., Schier A.F., Eggan K. Effcient CRISPR-Cas9- mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 2015;11:875-883. DOI 10.1016/j.celrep.2015.04.007.

29. Nishitani H., Lygerou Z., Nishimoto T. Proteolysis of DNA replication licensing factor Cdt1 in S-phase is performed independently of geminin through its N¬terminal region. J. Biol. Chem. 2004;279(29): 30807-30816. DOI 10.1074/jbc.M312644200.

30. Niu X., He W., Song B., Ou Z., Fan D., Chen Y., Fan Y., Sun X. Combining single strand oligodeoxynucleotides and CRISPR/Cas9 to correct gene mutations in β-thalassemia-induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2016;291(32):16576-16585. DOI 10.1074/jbc.M116.719237.

31. Orlando S.J., Santiago Y., DeKelver R.C., Freyvert Y., Boydston E.A., Moehle E.A., Choi V.M., Gopalan S.M., Lou J.F., Li J., Miller J.C., Holmes M.C., Gregory P.D., Urnov F.D., Cost G.J. Zinc-fnger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Res. 2010;38(15):e152. DOI 10.1093/nar/gkq512.

32. Richardson C.D., Ray G.J., DeWitt M.A., Curie G.L., Corn J.E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat. Biotechnol. 2016;34(3):339-344. DOI 10.1038/nbt.3481.

33. Rieder C.L., Cole R.W. Cold-shock and the Mammalian cell cycle. Cell Cycle. 2002;1(3):169-175.

34. Riesenberg S., Maricic T. Targeting repair pathways with small molecules increases precise genome editing in pluripotent stem cells. Nat. Commun. 2018;9(1):2164. DOI 10.1038/s41467-018-04609-7.

35. Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X., Skarnes W.C. Effcient genome modifcation by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat. Methods. 2014;11(4):399-402. DOI 10.1038/nmeth.2857.

36. Takayama K., Igai K., Hagihara Y., Hashimoto R., Hanawa M., Sakuma T., Tachibana M., Sakurai F., Yamamoto T., Mizuguchi H. Highly effcient biallelic genome editing of human ES/iPS cells using a CRISPR/Cas9 or TALEN system. Nucleic Acids Res. 2017;45(9): 5198-5207. DOI 10.1093/nar/gkx130.

37. Tidball A.M., Dang L.T., Glenn T.W., Kilbane E.G., Klarr D.J., Margolis J.L., Uhler M.D., Parent J.M. Rapid generation of human genetic loss-of-function iPSC lines by simultaneous reprogramming and gene editing. Stem Cell Reports. 2017;9(3):725-731. DOI 10.1016/j.stemcr.2017.07.003.

38. Turan S., Farruggio A.P., Srifa W., Day J.W., Calos M.P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Mol. Ther. 2016;24(4):685-696. DOI 10.1038/mt.2016.40.

39. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Williamson E.K., Schumacker P.T., Thompson C.B. Bcl-xL regulates the membrane potential and volume homeostasis of mitochondria. Cell. 1997;91(5):627-637.

40. Wang B., Li K., Wang A., Reiser M., Saunders T., Lockey R.F., Wang J.W. Highly effcient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 2015; 59(4):201-202, 204, 206-208. DOI 10.2144/000114339.

41. Watanabe K., Ueno M., Kamiya D., Nishiyama A., Matsumura M., Wataya T., Takahashi J.B., Nishikawa S., Nishikawa S., Muguruma K., Sasai Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 2007;25(6):681-686. DOI 10.1038/nbt1310.

42. Wen W., Cheng X., Fu Y., Meng F., Zhang J.P., Zhang L., Li X.L., Yang Z., Xu J., Zhang F., Botimer G.D., Yuan W., Sun C., Cheng T., Zhang X.B. High-level precise knockin of iPSCs by simultaneous reprogramming and genome editing of human peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Reports. 2018;10(6):1821-1834. DOI 10.1016/j.stemcr.2018.04.013.

43. Yang D., Scavuzzo M.A., Chmielowiec J., Sharp R., Bajic A., Borowiak M. Enrichment of G2/M cell cycle phase in human pluripotent stem cells enhances HDR-mediated gene repair with customizable endonucleases. Sci. Rep. 2016;6:21264. DOI 10.1038/srep21264.

44. Yu C., Liu Y., Ma T., Liu K., Xu S., Zhang Y., Liu H., La Russa M., Xie M., Ding S., Qi L.S. Small molecules enhance CRISPR genome editing in pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2015;16(2):142-147. DOI 10.1016/j.stem.2015.01.003.

45. Yumlu S., Stumm J., Bashir S., Dreyer A.K., Lisowski P., Danner E., Kühn R. Gene editing and clonal isolation of human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Methods. 2017;121-122: 29-44. DOI 10.1016/j.ymeth.2017.05.009.

46. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015;163(3):759- 771. DOI 10.1016/j.cell.2015.09.038.

47. Zhang J.P., Li X.L., Li G.H., Chen W., Arakaki C., Botimer G.D., Baylink D., Zhang L., Wen W., Fu Y.W., Xu J., Chun N., Yuan W., Cheng T., Zhang X.B. Effcient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 2017;18(1):35. DOI 10.1186/s13059-017-1164-8.

48. Zhang X.B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2013;11(5):264-274. DOI 10.1016/j.gpb.2013.09.001. Epub 2013 Sep. 21.