Preview

Вавиловский журнал генетики и селекции

Расширенный поиск

Применение РНК-направленной нуклеазы Cas9 для сайт-специфической модификации генома в протопластах cибирского сорта ячменя с высокой способностью к регенерации

https://doi.org/10.18699/VJ18.447

Полный текст:

Аннотация

Модификация геномов культурных растений при помощи компонентов бактериальной защитной системы CRISPR/Cas в настоящее время является быстроразвивающейся областью прикладной науки. Методика индукции сайт-специфических изменений в растительных геномах, как правило, включает такие этапы, как конструирование генетических векторов, содержащих гены нуклеазы Cas9 и химерной направляющей РНК, доставку плазмидной ДНК или рибонуклеопротеиновых частиц в клетки растений, что приводит к внесению изменений в выбранный сайт геномной ДНК, и последующую регенерацию растений из модифицированных клеток. Применение этой технологии в селекции ограничено тем, что генотипы в разной степени подвержены генетической трансформации и различаются по способности к регенерации in vitro. Генотип-зависимость эффективности биотехнологических манипуляций особенно ярко выражена у культурных зерновых злаков. В настоящей работе была проведена оценка эффективности регенерации растений in vitro из клеток незрелых зародышей десяти сибирских сортов ячменя. Было показано, что только один из исследуемых сортов сопоставим с модельным для биотехнологических и генно-инженерных работ сортом Golden Promise. Сорт Алей продемонстрировал самую высокую эффективность регенерации среди сибирских сортов ячменя и был выбран для проведения эксперимента по модификации генома в протопластах мезофилла листа. Для проведения модификации генома было выбрано два целевых гена, которые контролируют хозяйственные признаки. Ген Nud контролирует признак голозерности или пленчатости, ген Vrs1 – признак двурядности или шестирядности. Были сконструированы генетические век торы, несущие систему модификации генома, направленную на три сайта в двух целевых генах. Конструкции были введены в протопласты методом полиэтиленгликоль-зависимой трансформации, детекция мутаций осуществлялась методом глубокого секвенирования целевых последовательностей, амплифицированных с геномной ДНК трансформированной клеточной популяции. Мутации были выявлены в 6–20 % популяции трансформированных клеток. Делеции разного размера обнаружены в трех целевых сайтах, однонуклеотидные инсерции обнаружены только в одном из сайтов. Результаты, полученные в работе, демонстрируют возможность сайт-специфической модификации генома сибирского ячменя. Дальнейшие шаги по развитию технологии сайт-направленной модификации геномов культурных злаков потребуют разработки «генотип-независимых» методов генетической трансформации клеток и последующей регенерации растений из модифицированных клеток.

Просмотров: 1913


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2500-3259 (Online)