Проблемы сохранения in vitro гермоплазмы цитрусовых

Главные проблемы создания депонированной коллекции сортов цитрусовых in vitro, как и некоторых других древесных растений, – высокая степень грибной контаминации вегетативных почек и последующее снижение ростового потенциала введенных в культуру in vitro микропобегов. В связи с этим цель нашей работы – выявить эффективность различных путей деконтаминации вегетативных эксплантов и оценить возможность введения в культуру in vitro и сохранения в медленнорастущей коллекции ценных сортов лимона. Наилучшие результаты поверхностной стерилизации были получены в вариантах с использованием растворов Велтолена 0.3 % – 25 минут и Доместос 10 % – 25–30 минут. В этих вариантах было получено 27.7–33.0  % стерильных жизнеспособных эксплантов соответственно. Однако после третьего пассажа выход стерильных эксплантов снизился до 10 % из-за вторичного инфицирования побегов эндофитными микроорганизмами. Использование биоцида («Гавриш») в питательной среде в концентрации 1 мл/л помогло повысить выход стерильных жизнеспособных эксплантов до 50 %. Несмотря на получение асептической культуры и начало морфогенеза, с течением времени происходило снижение фотосинтетической активности и содержания пигментов в листьях микропобегов. Ростовой потенциал микропобегов снижался с каждым последующим пассажем. После третьего пассажа микропобеги сбрасывали пожелтевшие листья, и рост их прекращался. Так, через 8 месяцев консервации выжило 37.35 % микропобегов на среде 1/2 Мурасиге–Скуга, их прирост составлял 0.33 см, а через 10 месяцев осталось лишь 14.6 % микропобегов. То есть спустя 10 месяцев консервации большая часть микропобегов погибла. Уже через три месяца консервации у растений наблюдалось существенное снижение индекса жизнеспособности и коэффициента фотосинтетической активности. Содержание хлорофилла a в листьях снижалось с 1.59 до 1.14 мг/г за 12 месяцев консервации in vitro. Аналогичная тенденция отмечена по содержанию хлорофилла b и каротиноидов. Эксперименты проводились в течение пяти лет с использованием разных сортов лимона и других цитрусовых. Таким образом, микроразмножение и создание генбанка in vitro ценных сортов лимона все еще остается проблематичным и требует новых технических решений по причине низкого ростового потенциала эксплантов пазушных почек, что согласуется с данными других исследователей.

цитрусовые культуры, пазушные почки, контаминация, микроразмножение, in vitro консервация, питательная среда, генетическая однородность, эндофиты

1. Belous O.G., Maliukova L.S., Kozlova N.V. Effect of mineral fertilizers on the pigment composition of leaves of tea plants in the conditions of subtropics of Russia. Subtropicheskoe i Dekorativnoe Sadovodstvo = Subtropical and Ornamental Horticulture. 2011;44:135-143. (in Russian)

2. Budagovskaya O.N., BudagovskyA.V., Budagovsky I.A., Solovyh N.V. A method for assessing the functional state of plants in vitro without braking sterility. Patent RU No. 0002604302 of 10.12.2016. (in Russian)

3. Çölgeçen H., Koca U., Toker G. Influence of different sterilization methods on callus initiation and production of pigmented callus in Arnebia densiflora Ledeb. Turk. J. Biol. 2009;35:513-520. DOI 10.3906/biy-0911-161.

4. Engelmann F. In vitro conservation methods. In: Callow J.A., FordLloyd B.V., Newbury H.J. (Eds.). Biotechnology and Plant Genetic Resources: Conservation and Use. CAB International, Wellingford, 1997;119-162.

5. Gogoi G., Borua P.K. Standardization parameters for critical problems encountered in plant in vitro culture technique. Int. J. Curr. Res. 2014;6(12):10964-10973.

6. Kloepper J.W., McInroy J.A., Hu C.-H. Association of plant damage with increased populations of deleterious endophytes following use of Benlate systemic fungicide. In: Schneider C., Leifert C., Feldmann F. (Eds.). Proc. 5th Int. Symp. “Endophytes for Plant Protection: the State of the Art” (Humboldt University, Berlin, 26–29 May, 2013). Berlin-Dahlem, 2013;56-69.

7. Kolomiets T.M., Malyarovskaya V.I., Gvasaliya M.V., Samarina L.S., Sokolov R.N. Micropropagation in vitro of subtropical, ornamental crops and endemics of the western Caucasus: original and optimized protocols. Selskokhozyastvennaya Biologia = Agricultural Biology. 2014;3:49-58. (in Russian)

8. Krishna H., Alizadeh M., Singh D., Singh U., Chauhan N., Eftekhari M., Sadh R.K. Somaclonal variations and their applications in horticultural crops improvement. 3 Biotech. 2016;6(1):54. DOI 10.1007/s13205-016-0389-7.

9. Krueger R.R., Navarro L. Citrus Germplasm Resources. In: Khan I.A. (Ed.). Citrus: Genetics, Breeding and Biotechnology. CAB International, 2007;45-150.

10. Kulyan R.V. The genetic collection of citrus fruits is the basis for isolating the sources of economically valuable traits. Bulleten Michurinskogo Gosudarstvennogo Agrarnogo Universiteta = Bulletin of Michurin State Agrarian University. 2015;4:52-56. (in Russian)

11. Marin M.L., Duran-Vila N. Conservation of Citrus germplasm in vitro. Am. Soc. Hortic. Sci. 1991;116:740-746.

12. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15:473-497.

13. Niedz R.P., Bausher M.G. Control of in vitro contamination of explants from greenhouse- and field-grown trees. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2002;38:468-471.

14. Pence V.C. The possibilities and challenges of in vitro methods for plant conservation. Kew Bull. 2010;65:539-547.

15. Perez-Tornerо C.I., Tallon I., Porras I. An efficient protocol for micropropagation of lemon (Citrus limon) from mature nodal segments. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2009;100:263-271.

16. Rathore J.S., Rathore M.S., Singh M., Singh R.P., Shekhawat N.S. Micropropagation of mature tree of Citrus limon. Indian J. Biotechnol. 2007;6:239-244.

17. Ryndin A.V., Kulyan R.V. Collection of citrus cultures in humid subtropics of Russia. Sadovodstvo i Vinogradarstvo = Horticulture and Viticulture. 2016;5:24-30. (in Russian)

18. Samanhudi A.T.S., Muji R. In vitro axillary bud multiplication of Citrus nobilis Lour. in Indonesia. J. Life Sci. 2010;4(4):39-44.

19. Samarina L.S., Kolomiets Т.М., Gorshkov V.M. Evaluation of the regeneration capacity of Citrus explants in vitro. Sadovodstvo i Vinogradarstvo = Horticulture and Viticulture. 2012;6:27-30. (in Russian)

20. Shlyk A.A. Biosynthesis of chlorophyll and formation of photosynthetic systems. In: Theoretical Foundations of Photosynthetic Productivity. Moscow, 1971. (in Russian)