Простой и эффективный метод экстракции полярных метаболитов из листьев гуара (Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.) для GС-МS метаболомного анализа

Гуар Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. – новая для России сельскохозяйственная культура, востребованная в газо-, нефтедобывающей и пищевой промышленности. В связи с развитием «омиксных» технологий и для выявления ценных для селекции генов представляет интерес сравнительное изучение различных сортов и линий гуара с помощью метаболомики и функциональной геномики. Для массового скрининга метаболомных профилей образцов гуара из коллекции Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова с использованием GС-МS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) метаболомного анализа на первых этапах важно подобрать наиболее оптимальный метод экстракции метаболитов из анализируемых образцов. Результатом метаболомного анализа чаще всего является статистическая модель различий в корреляционной структуре метаболитной сети изучаемых объектов. Надежное квантирование метаболитных профилей критично для различения сортов одной культуры, так как профили метаболитов в тканях листа у растений одного вида, культивируемых в равных условиях, практически не отличаются по набору метаболитов. В метаболомной практике при подготовке образцов к GС-MS-анализу распространено два способа экстракции полярных соединений. Один из широко используемых методов пробоподготовки основан на длительной экстракции метаболитов из цельных незамороженных тканей с помощью растворителя метанола, а другой – на краткосрочной метанольной экстракции метаболитов из замороженного и подвергнутого гомогенизации материала. Преимущества и недостатки этих двух методов побудили нас к разработке нового подхода, позволяющего избежать затруднений при анализе метаболомных профилей листьев различных сортов гуара. Предложенный нами метод объединяет преимущества двух выше указанных способов пробоподготовки, а именно: исключает потерю метаболитов на этапе центрифугирования и способствует полной деструкции всех клеточных стенок, обеспечивая максимальный уровень экстракции полярных метаболитов. Метод состоит в том, что лист быстро замораживается в жидком азоте с последующим размораживанием в холодном метаноле. При этом ткани листа сохраняют морфологическую целостность, и последующее центрифугирование, необходимое при гомогенизации, исключается. Нами была показана эффективность использования этого усовершенствованного метода на образцах листьев трех линий гуара. Установлено, что количество экстрагируемых метаболитов увеличивается более чем в пять раз по сравнению с метанольной экстракцией из свежего листа без замораживания и более чем в два раза в сравнении с экстракцией метанолом после замораживания и гомогенизации. Экстракция метаболитов новым методом позволяет проводить GС-MS-анализ образцов гуара с наименьшими потерями и высокой точностью, необходимой при выявлении сортовых различий.

Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub., гуар, газовая хроматография, масс-спектрометрия, метаболомика, экстракция метаболитов

1. Лоскутов И.Г., Шеленга Т.В., Конарев А.В., Шаварда А.Л., Блинова Е.В., Дзюбенко Н.И. Метаболомный подход к сравнительному анализу диких и культурных видов овса (Avena L.). Вавиловский журнал генетики и селекции. 2016;20(5):636-642. DOI 10.18699/VJ16.185.

2. Смоликова Г.Н., Шаварда А.Л., Алексейчук И.В., Чанцева В.В., Медведев С.С. Mетаболомный подход к оценке сортовой специфичности семян Brassica napus L. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015;19(1):121-127. DOI 10.18699/VJ15.015.

3. Alonso A., Marsal S., Julià A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Front. Bioeng. Biotechnol. 2015; 3(23):1-20. DOI 10.3389/fbioe.2015.00023.

4. Bundy J.G., Spurgeon D.J., Svendsen C., Hankard P.K., Osborn D., Lindon J.C., Nicholson J.K. Earthworm species of the genus Eisenia can be phenotypically differentiated by metabolic profiling. FEBS Letters. 2002;521(1-3):115-120. DOI 10.1016/s0014-5793(02) 02854-5.

5. Catchpole G., Beckmann M., Enot D., Mondhe M., Zywicki B., Taylor J., Fiehn O. Hierarchical metabolomics demonstrates substantial compositional similarity between genetically modified and conventional potato crops. Proc. Natl. Acad. Sci. 2005;102(40):1445814462. DOI 10.1073/pnas.0503955102.

6. Chong J., Soufan O., Li C., Caraus I., Li S., Bourque G., Wishart D., Xia J. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucl. Acids Res. 2018;46(1):486-494. DOI 10.1093/nar/gky310.

7. Farag M.A., Gad H.A., Heiss A.G., Wessjohann L.A. Metabolomics driven analysis of six Nigella species seeds via UPLC-qTOF-MS and GC–MS coupled to chemometrics. Food Chem. 2014;151:333342. DOI 10.1016/j.foodchem.2013.11.032.

8. Fiehn O. Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks. Comp. Funct. Genomics. 2001;2(3):155-168. DOI 10.1002/cfg.82.

9. Fiehn O. Metabolomics – the link between genotypes and phenotypes. Plant Mol. Biol. 2002;48:155-171. DOI 10.1007/978-94-010-04480_11.

10. Fiehn O., Kopka J., Dörmann P., Altmann T., Trethewey R., Willmitzer L. Metabolite profiling for plant functional genomics. Nat. Biotechnol. 2000;18(11):1157-1161. DOI 10.1038/81137.

11. Hall R., Beale M., Fiehn O., Hardy N., Sumner L., Bino R. Plant metabolomics: the missing link in functional genomics strategies. Plant Cell. 2002;14(7):1437-1440. DOI 10.1105/tpc.140720.

12. Kanani H., Chrysanthopoulos P.K., Klapa M.I. Standardizing GC–MS metabolomics. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008;871(2):191-201. DOI 10.1016/j.jchromb.2008.04.049.

13. Kanani H.H., Klapa M.I. Data correction strategy for metabolomics analysis using gas chromatography-mass spectrometry. Metab. Eng. 2007;9(1):39-51. DOI 10.1016/j.ymben.2006.08.001.

14. Lisec J., Schauer N., Kopka J., Willmitzer L., Fernie A.R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nat. Protoc. 2006;1(1):387-396. DOI 10.1038/nprot.2006.59.

15. Maharjan R.P., Ferenci T. Global metabolite analysis: the influence of extraction methodology on metabolome profiles of escherichia coli. Anal. Biochem. 2003;313(1):145-154. DOI 10.1016/S0003-2697(02) 00536-5.

16. Martineau E., Tea I., Loaëc G., Giraudeau P., Akoka S. Strategy for choosing extraction procedures for NMR-based metabolomic analysis of mammalian cells. Anal. Bioanal. Chem. 2011;401(7):21332142. DOI 10.1007/s00216-011-5310-y.

17. Puzanskiy R.K., Yemelyanov V.V., Kliukova M.S., Shavarda A.L., Shtark O.Y., Yurkov A.P., Shishova M.F. Optimization of metabolite profiling for Black Medick (Medicago lupulina) and Peas (Pisum sativum). Applied Biochem. Microbiol. 2018;54(4):442-448. DOI 10.1134/S0003683818040129.

18. Roessner U., Luedemann A., Brust D., Fiehn O., Linke T., Willmitzer L., Fernie A.R. Metabolic profiling allows comprehensive phenotyping of genetically or environmentally modified plant systems. The Plant Cell. 2001;13(1):11-29. DOI 10.1105/tpc.13.1.11.

19. Röhlig R.M., Eder J., Engel K.H. Metabolite profiling of maize grain: differentiation due to genetics and environment. Metabolomics. 2009;5(4):459-477. DOI 10.1007/s11306-009-0171-5.

20. Shinbo Y., Nakamura Y., Altaf-Ul-Amin M., Asahi H., Kurokawa K., Arita M., Kanaya S. KNApSAcK: a comprehensive species-metabolite relationship database. Plant Metabolomics. 2006;57:165-181. DOI 10.1007/3-540-29782-0_13.

21. Wishart D.S. Advances in metabolite identification. Bioanalysis. 2011; 3(15):1769-1782. DOI 10.4155/bio.11.155