Оптимизированный метод подсчета количества вирусных частиц с помощью электронной микроскопии

Вирусы поражают все типы организмов, от растений и животных до бактерий и архей. При исследовании образцов, содержащих вирусы, неизбежно встает вопрос количественного определения вирусных частиц в пробе. Одна из наиболее простых и эффективных методик количественного определения вирусных частиц в препарате – использование электронной микроскопии, однако основным ограничением метода является относительно высокий предел обнаружения (107 частиц/мл). Часто такая чувствительность недостаточна и может приводить к ошибочной диагностике. Цель данной работы заключалась в разработке методики, позволяющей более точно оценивать количество вирусных частиц и работать с образцами, в которых концентрация ниже, чем 107 частиц/мл. Метод заключается в концентрировании вирусных частиц на мембране из полиэфирсульфона, применяемой в центрифужных концентраторах, с последующим подсчетом с помощью электронного микроскопа. В качестве модельного объекта были выбраны env-псевдовирусы, созданные с использованием лентивирусной системы, которая позволяет получать стандартизованные образцы вирусоподобных частиц. Суспензию вирусных частиц (объемом 20 мл) помещали в центрифужный концентратор и центрифугировали. Затем извлекали мембрану из концентратора и оценивали количество осажденных на мембране частиц с помощью электронного микроскопа, используя метод ультратонких срезов. Количество вирусных частиц на всей поверхности фильтра (площадь 4 см2) составляло 4×107 вирионов, исходная концентрация псевдовирусов в образце – 2×106 на 1 мл (4×107 частиц/20 мл). Таким образом, предложенная методика позволяет преодолеть основной недостаток количественного определения вирусов с помощью электронной микроскопии, связанный с относительно высоким пределом обнаружения (107 частиц/мл). Кроме того, центрифужный концентратор дает возможность последовательно прогнать через один и тот же фильтр значительные объемы суспензии, содержащей вирусы, что также может привести к повышению чувствительности метода. Предложенный подход позволяет повысить чувствительность, точность и воспроизводимость количественного анализа различных образцов, содержащих вирусы животных, растений и человека, с использованием электронной микроскопии.

1. Blancett C.D., Fetterer D.P., Koistinen K.A., Morazzani E.M., Monninger M.K., Piper A.E., Kuehl K.A., Kearney B.J., Norris S.L., Rossi C.A., Glass P.J., Sun M.G. Accurate virus quantitation using a Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) detector in a scanning electron microscope. J. Virol. Methods. 2017;248:136-144. DOI 10.1016/j.jviromet.2017.06.014.

2. Ferris M.M., Stoffel C.L., Maurer T.T., Rowlen K.L. Quantitative intercomparison of transmission electron microscopy, flow cytometry, and epifluorescence microscopy for nanometric particle analysis. Anal. Biochem. 2002;304(2):249-256. DOI 10.1006/abio. 2002.5616.

3. Goldsmith C.S., Miller S.E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2009;22(4):552- 563. DOI 10.1128/CMR.00027-09.

4. Harris R.J., Horne R.W. Negative staining: a brief assessment of current technical benefits, limitations and future possibilities. Micron. 1994;25(1):5-13. DOI 10.1016/0968- 4328(94)90051-5.

5. Heider S., Metzner C. Quantitative real-time single particle analysis of virions. Virology. 2014;462-463(1):199-206. DOI 10.1016/j.virol. 2014.06.005.

6. Malenovska H. Virus quantitation by transmission electron microscopy, TCID50, and the role of timing virus harvesting: a case study of three animal viruses. J. Virol. Methods. 2013;191(2):136-140. DOI 10.1016/j.jviromet.2013.04.008.

7. Montefiori D.C. Measuring HIV Neutralization in a Luciferase Reporter Gene Assay. In: Prasad V.R., Kalpana G.V. (Eds.). HIV Protocols. 2nd edn. (Ser.: Methods in Molecular Biology). 2009;485:395-405. DOI 10.1007/978-1-59745-170- 3_26.

8. Reid G.G., Milne E.W., Coggins L.W., Wilson N.J., Smith K.T., Shepherd A.J. Comparison of electron microscopic techniques for enumeration of endogenous retrovirus in mouse and Chinese hamster cell lines used for production of biologics. J. Virol. Methods. 2003;108(1):91-96. DOI 10.1016/S0166- 0934(02)00263-X.

9. Rossi C.A., Kearney B.J., Olschner S.P., Williams P.L., Robinson C.G., Heinrich M.L., Zovanyi A.M., Ingram M.F., Norwood D.A., Schoepp R.J. Evaluation of ViroCyt® Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 2015;7(3):857-872. DOI 10.3390/v7030857.

10. Ryzhikov A.B., Sarkisyan K.A., Karpenko L.I., Pyankova O.G., Shalamova L.A., Borisevich I.V., Vorobyeva M.S., Bogryantseva M.P., Ilyichev A.A., Montefiori D.S., Nechaeva E.A. Testing in preclinical trials method for determining the neutralizing activity of vaccine-candidate against HIV infection CombiHIVvac using HIV-1 pseudoviruses technology. Ehidemiologiya i Vaktsynoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinoprofilactic. 2012;2(63):70-75. (in Russian)

11. Sergeev Al.A., Kabanov A.S., Bulychev L.E., Sergeev Ar.A., Pyankov O.V., Bodnev S.A., Galahova D.O., Zamedyanskaya A.S., Titova K.A., Glotov A.G., Taranov O.S., Omigov V.V., Shishkina L.N., Agafonov A.P., Sergeev A.N. The Possibility of Using the ICR Mouse as an Animal Model to Assess Antimonkeypox Drug Efficacy. Transbound. Emerg. Dis. 2016;63:e419-e430. DOI 10.1111/tbed.12323.