Модифицированный метод дроплет-витрификации для криоконсервации апексов in vitro растений картофеля

Коллекции возделываемого картофеля Solanum tuberosum, сохраняемые в полевых генбанках, несут значительные потери из-за воздействия экстремальных факторов внешней среды, заболеваний и вредителей. Практическое решение проблемы надежного хранения генофонда возделываемого картофеля состоит в создании дублетных криоколлекций, сохраняемых при сверхнизких температурах в криобанках. Известно несколько методов криоконсервации картофеля, из них в настоящее время в мировых генбанках наиболее широко используется метод дроплет-витрификации, разработанный Б. Панисом с коллегами в 2005 г. В нашей статье представлено подробное описание модифицированного метода дроплет-витрификации, который применяется для криоконсервации апексов in vitro растений картофеля во Всероссийском институте генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова (ВИР). Модифицированный в ВИР метод включает основные этапы оригинального метода дроплет-витрификации, разработанного Б. Панисом с коллегами: 1) подготовка растительного материала; 2) изоляция апексов микрорастений; 3) обработка эксплантов растворами с криопротекторами; 4) криоконсервация/погружение в жидкий азот; 5) оттаивание; 6) посткриогенное восстановление и учет регенерационной способности. Предложенные нами модификации этапов 1, 2 и 6 позволяют существенно сократить продолжительность экспериментов по криоконсервации в сравнении с оригинальным методом. В работе представлены результаты экспериментов по криоконсервации аборигенных южноамериканских сортов и современных селекционных сортов картофеля, которые были выполнены с использованием модифицированного в ВИР метода дроплет-витрификации. Большая часть (76.7 %) изученных образцов культурного картофеля характеризовалась высокими показателями посткриогенной регенерации (40–95 %), и у 23.3 % изученных образцов частота регенерации после замораживания–оттаивания варьировала от 20 до 39 %, что соответствует предельно допустимым минимальным значениям для закладки на длительное хранение в криобанк. В настоящее время модифицированный метод дроплет-витрификации используется для расширения криоколлекции культурных видов картофеля в ВИР.

1. Гавриленко Т.А., Дунаева С.Е., Трускинов Э.В., Антонова О.Ю., Пендинен Г.И., Лупышева Ю.В., Роговая В.В., Швачко Н.А. Стратегия долгосрочного сохранения генофонда вегетативно размножаемых сельскохозяйственных растений в контролируемых условиях среды. Труды по прикл. ботанике, генетике и селекции. СПб., 2007;164:273-285.

2. Дунаева С.Е., Пендинен Г.И., Антонова О.Ю., Швачко Н.А., Волкова Н.Н., Гавриленко Т.А. Сохранение вегетативно размножаемых культур в in vitro и криоколлекциях. СПб.: ВИР, 2011.

3. Ухатова Ю.В., Гавриленко Т.А. Методы криоконсервации вегетативно размножаемых культурных растений. Биотехнология и селекция растений. 2018;1(1):52-63. DOI 10.30901/2658-62662018-1-52-63.

4. Ухатова Ю.В., Овэс Е.В., Волкова Н.Н., Гавриленко Т.А. Криоконсервация селекционных сортов картофеля в ВИРе. Труды по прикл. ботанике, генетике и селекции. СПб., 2017;178(3):13-20. DOI 10.30901/2227-8834-2017-3-13-20.

5. Филипенко Г.И. Развитие системы низкотемпературного хранения и криоконсервации генофонда растений в ВИР имени Н.И. Вавилова. Труды по прикл. ботанике, генетике и селекции. СПб., 2007;164:263-272.

6. Antonova O.Y., Shvachko N.A., Novikova L.Y., Shuvalov O.Y., Kostina L.I., Klimenko N.S., Shuvalova A.R., Gavrilenko T.A. Genetic diversity of potato varieties bred in Russia and its neighboring countries based on the polymorphism of SSR-loci and markers associated with resistance R-genes. Russ. J. Genet.: Appl. Res. 2017;7(5):489500. DOI 10.1134/S2079059717050021.

7. Bamberg J.B., Martin M.W., Abad J., Jenderek M.M., Tanner J., Donnelly D.J., Nassar M.K., Veilleux R.E., Novy R.G. In vitro technology at the US Potato Genebank. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2016;52:213-225. DOI 10.1007/s11627-016-9753-x.

8. Engelmann F. Cryopreservation of clonal crops: a review of key parameters. Acta Hort. 2014;1039:31-39.

9. FAO. Genebank Standards for Plant Genetic Resources for Food and Agriculture. Rev. ed. Rome, 2014.

10. Gavrilenko T., Antonova O., Ovchinnikova A., Novikova L., Krylova E., Mironenko N., Pendinen G., Islamshina A., Shvachko N., Kiru S., Kostina L., Afanasenko O., Spooner D. A microsatellite and morphological assessment of the Russian National Potato Collection. Genet. Resour. Crop Evol. 2010;57(8):1151-1164. DOI 10.1007/s10722-010-9554-8.

11. IPGRI. Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm. Current research progress and applications. Engelmann F., Takagi H. (Eds.). 2000.

12. Kaczmarczyk A., Rokka V.M., Keller E.R.J. Potato shoot tip cryopreservation. A review. Potato Res. 2011;54:45-79. DOI 10.1007/s11540-010-9169-7.

13. Keller E.R.J., Sunura A., Leunufna S., Grűbe M. Slow growth storage and cryopreservation – tools to facilitate germplasm maintenance of vegetatively propagated crops in living plant collections. J. Refrigeration. 2006;29:411-417.

14. Kim H.H., Yoon J.W., Park Y.E., Cho E.G., Sohn J.K., Kim T.S., Engelmann F. Cryopreservation of potato cultivated varieties and wild species: critical factors in droplet vitrification. CryoLetters. 2006; 27(4):223-234.

15. Kushnarenko S., Romadanova N., Aralbayeva M., Zholamanova S., Alexandrova A., Karpova O. Combined ribavirin treatment and cryotherapy for efficient Potato virus M and Potato virus S eradication in potato (Solanum tuberosum L.) in vitro shoots. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2017;53(4):425-432. DOI 10.1007/s11627-017-9839-0.

16. Murashige T., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15: 473-497.

17. Niino T., Valle Arizaga M. Cryopreservation for preservation of potato genetic resources. Breed. Sci. 2015;65(1):41-52. DOI 10.1270/jsbbs.65.41.

18. Panis B., Piette B., Swennen R. Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all Musaceae. Plant Sci. 2005;168:45-55. DOI 10.1016/j.plantsci.2004.07.022.

19. Panis B., Van den Houwe I., Swennen R., Rhee J., Roux N. Securing plant genetic resources for perpetuity through cryopreservation. Indian J. Plant. Genet. Resour. 2016;29(3):300-302.

20. Panta A., Panis B., Ynouye C., Swennen R., Roca W. Development of a PVS2 droplet vitrification method for potato cryopreservation. CryoLetters. 2014;35(3):255-266.

21. Panta A., Panis B., Ynouye C., Swennen R., Roca W., Tay D., Ellis D. Improved cryopreservation method for the long-term conservation of the world potato germplasm collection. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2015;120:117-125. DOI 10.1007/s11240-014-0585-2.

22. Sakai A., Kobayashi S., Oiyama I. Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) by vitrification. Plant Cell Rep. 1990;9(1):30-33. DOI 10.1007/bf00232130.

23. Shvachko N., Gavrilenko T. Cryopreservation of potato landraces using droplet-vitrification method. In: Grapin A., Keller J., Lynch P., Panis B., Revilla A., Engelmann F. (Eds.). Cryopreservation of Crop Species in Europe: Proc. of COST Action 871 Final meeting. Angers, France, 2011;135-137.

24. Towill L.E. Improved survival after cryogenic exposure of shoot tips derived from in vitro plantlet cultures of potato. Cryobiology. 1983;20:567-573.

25. Vollmer R., Villagaray R., Cárdenas J., Castro M., Chávez O., Anglin N.L., Ellis D. A large-scale viability assessment of the potato cryobank at the International Potato Center (CIP). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 2017;53(4):309-317. DOI 10.1007/s11627-0179846-1.

26. Vollmer R., Villagaray R., Egusquiza V., Espirilla J., Garcia M., Torres A., Rojas E., Panta A., Barkley N.A., Ellis D. The potato cryobank at the International Potato Center (CIP): a model for long term conservation of clonal plant genetic resources collections of the future. CryoLetters. 2016;37(5):318-329.

27. Yoon J.W., Kim H.H., Ko H.C., Hwang H.S., Hong E.S., Cho E.G., Engelmann F. Cryopreservation of cultivated and wild potato varieties by droplet vitrification: effect of subculture of mother-plants and of preculture of shoot tips. CryoLetters. 2006;27(4):211-222.