Конструирование постоянно активной киназы 2 рибосомного белка s6 из Arabidopsis thaliana (AtrPs6k2) и тестирование ее активности in vitro

Рибосомный белок S6 (RPS6) – единственный белок 40S субчастиц эукариотических рибосом, способный фосфорилироваться. Рибосомы с фосфорилированным RPS6 могут селективно транслировать 5’TOP (5’-terminal oligopyrimidine)-содержащие мРНК, которые кодируют большинство белков трансляционного аппарата клеток. Исследование трансляционного контроля 5’TOP-мРНК, которые преимущественно транслируются, когда RPS6 фосфорилирован, и перестают транслироваться, когда RPS6 дефосфорилируется, является особенно важным. В клетках Arabidopsis thaliana AtRPS6 фосфорилируется киназой AtRPS6K2, для активации которой, в свою очередь, требуется ее фосфорилирование киназами верхнего уровня (AtPDK1 – по серину (S) 296, AtTOR – по треонину (T) 455 и также по S437). Мы клонировали кДНК-ген AtRPS6K2 и провели его мутагенез in vitro, заменив кодоны S296, S437 и T455 на триплеты, кодирующие фосфомиметическую глутаминовую кислоту (E). После экспрессии обеих кДНК в клетках Escherichia coli были выделены два рекомбинантных белка: немутированный вариант – AtRPS6K2 и мутированный вариант – AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E), предположительно, находящийся в стабильно активном состоянии. Активность этих киназ была протестирована in vitro. Показано, что обе киназы способны фосфорилировать рибосомный белок TaRPS6 в составе 40S рибосомных субчастиц, выделенных из зародышей пшеницы (Triticum aestivum L.), но активность нативной киназы была ниже в сравнении с ее фосфомиметической формой. Способность рекомбинантной нативной киназы фосфорилировать TaRPS6 может быть объяснена ее фосфорилированием бактериальными киназами на стадиях экспрессии и выделения. Фосфомиметически мутированная киназа AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) может служить удобным средством для исследования избирательной трансляции 5’TOP-содержащих мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, в которой большинство 40S рибосомных субчастиц имеет фосфорилированную форму TaRPS6. Кроме того, такой подход может найти биотехнологическое применение для создания генетически модифицированных растений с увеличенной биомассой и продуктивностью за счет стимуляции роста и деления клеток.

пшеница (Triticum aestivum), белок S6 (TaRPS6) 40S субчастицы рибосом, Arabidopsis thaliana, AtRPS6-киназа2, фосфомиметическая мутация, фосфорилирование Ta RPS6

1. Bakshi A., Moin M., Madhav M.S., Kirti P.B. Target of rapamycin, a master regulator of multiple signalling pathways and a potential candidate gene for crop improvement. Plant Biol. (Stuttg.). 2019;21(2): 190-205. DOI 10.1111/plb.12935.

2. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 1976;7(72):248-254. DOI 10.1006/abio.1976.9999.

3. Caldana C., Martins M.C.M., Mubeen U., Urrea-Castellanos R. The magic ‘hammer’ of TOR: the multiple faces of a single pathway in the metabolic regulation of plant growth and development. J. Exp. Bot. 2019;70:2217-2225. DOI 10.1093/jxb/ery459.

4. Deprost D., Yao L., Sormani R., Moreau M., Leterreux G., Nicolai M., Bedu M., Robaglia Ch., Meyer Ch. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Rep. 2007;8(9):864-870. DOI 10.1038/sj.embor.7401043.

5. Enganti R., Cho S.K., Toperzer J.D., Urquidi-Camacho R.A., Cakir O.S., Ray A.P., Abraham P.E., Hettich R.L., von Arnim A.G. Phosphorylation of ribosomal protein RPS6 integrates light signals and circadian clock signals. Front. Plant Sci. 2017;8(2210). DOI 10.3389/fpls.2017.02210.

6. Henriques R., Bögre L., Horváth B., Magyar Z. Balancing act: matching growth with environment by the TOR signalling pathway. J. Exp. Bot. 2014;65(10):2691-2701. DOI 10.1093/jxb/eru04.

7. Immanuel T.M., Greenwood D.R., MacDiarmid R.M. A critical review of translation initiation factor eIF2α kinases in plants – regulating protein synthesis during stress. Funct. Plant Biol. 2012;39:717-735. DOI 10.1071/FP12116.

8. Kim Y.K., Kim S., Shin Y.J., Hur Y.S., Kim W.Y., Lee M.S., Cheon C.I., Verma D.P. Ribosomal protein S6, a target of rapamycin, is involved in the regulation of rRNA genes by possible epigenetic changes in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 2014;289:3901-3912. DOI 10.1074/jbc.M113.515015.

9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-685. DOI 10.1038/227680a0.

10. Lee D.H., Park S.J., Ahn C.S., Pai H.S. MRF family genes are involved in translation control, especially under energy-deficient conditions, and their expression and functions are modulated by the TOR signaling pathway. Plant Cell. 2017;29:2895-2920. DOI 10.1105/tpc.17.00563.

11. Matasova N.B., Myltseva S.V., Zenkova M.A., Graifer D.M., Vladimirov S.N., Karpova G.G. Isolation of ribosomal subunits containing intact rRNA from human placenta. Estimation of functional activity of 80S ribosomes. Anal. Biochem. 1991;198:219-223. DOI 10.1016/0003-2697(91)90416-q.

12. Meyuhas O., Kahan T. The race to decipher the top secrets of TOP mRNAs. Biochim. Biophys. Acta. 2015;1849:801-811. DOI 10.1016/j.bbagrm.2014.08.015.

13. Otterhag L., Gustavsson N., Alsterfjord M., Pical C., Lehrach H., Gobom J., Sommarin M. Arabidopsis PDK1: identification of sites important for activity and downstream phosphorylation of S6 kinase. Biochimie. 2006;88:11-21. DOI 10.1016/j.biochi.2005.07.005.

14. Ren M., Qiu S., Venglat P., Xiang D., Feng L., Selvaraj G., Datla R. Target of rapamycin regulates development and ribosomal RNA expression through kinase domain in Arabidopsis. Plant Physiol. 2011; 155:1367-1382. DOI 10.1104/pp.110.169045.

15. Rexin D., Meyer C., Robaglia C., Veit B. TOR signalling in plants. Biochem. J. 2015;470:1-14. DOI 10.1042/BJ20150505.

16. Roustan V., Jain A., Teige M., Ebersberger I., Weckwerth W. An evolutionary perspective of AMPK-TOR signaling in the three domains of life. J. Exp. Bot. 2016;67(13):3897-3907. DOI 10.1093/jxb/erw211.JXB. 2016.

17. Ryabova L.A., Robaglia Ch., Meyer Ch. Target of rapamycin kinase: central regulatory hub for plant growth and metabolism. J. Exp. Bot. 2019;70(8):2211-2216. DOI 10.1093/jxb/erz108.

18. Schepetilnikov M., Dimitrova M., Mancera-Martínez E., Geldreich A., Keller M., Ryabova L.A. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. EMBO J. 2013;32:1087-1102. DOI 10.1038/emboj.2013.61.

19. Shaikhin S.M., Smailov S.K., Lee A.V., Kozhanov E.V., Iskakov B.K. Interaction of wheat germ translation initiation factor 2 with GDP and GTP. Biochimie. 1992;74:447-454. DOI 10.1016/0300-9084(92)90085-s.

20. Shi L., Wu Y., Sheen J. TOR signaling in plants: conservation and innovation. Development. 2018;145(13). DOI 10.1242/dev.160887.

21. Song Y., Li L., Yang Zh., Zhao G., Zhang X., Wang L., Zheng L., Zhuo F., Yin H., Ge X., Zhang Ch., Yang Z., Ren M., Li F. Target of rapamycin (TOR) regulates the expression of IncRNAs in response to abiotic stresses in cotton. Front. Genet. 2019;9(690). DOI 10.3389/fgene.2018.00690.

22. Turck F., Kozma S.C., Thomas G., Nagy F. A heat-sensitive Arabidopsis thaliana kinase substitutes for human p70s6k function in vivo. Mol. Cel. Biol. 1998;18:2038-2044. DOI 10.1128/mcb.18.4.2038.

23. Turck F., Zilbermann F., Kozma S.C., Thomas G., Nagy F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 2004;134:1527-1535. DOI 10.1104/pp.103.035873.

24. Werth E.G., McConnell E.W., Couso Lianez I., Perrine Z., Crespo J.L., Umen J.G., Hicks L.M. Investigating the effect of target of rapamycin kinase inhibition on the Chlamydomonas reinhardtii phosphoproteome: from known homologs to new targets. New Phytol. 2019; 221:247-260. DOI 10.1111/nph.15339.

25. Williams A.J., Werner-Fraczek J., Chang I.-F., Bailey-Serres J. Regulated phosphorylation of 40S ribosomal protein S6 in root tips of maize. Plant Physiol. 2003;132:2086-2097. DOI 10.1104/pp.103.022749.

26. Wolters H., Jürgens G. Survival of the flexible: hormonal growth control and adaptation in plant development. Nat. Rev. Genet. 2009;10: 305-317. DOI 10.1038/nrg2558.

27. Wu Y., Shi L., Li L., Fu L., Liu Y., Xiong Y., Sheen J. Integration of nutrient, energy, light, and hormone signalling via TOR in plants. J. Exp. Bot. 2019;70(8):2227-2238. DOI 10.1093/jxb/erz028.

28. Xiong Y., Sheen J. Novel links in the plant TOR kinase signaling network. Curr. Opin. Plant Biol. 2015;28:83-91. DOI 10.1016/j.pbi.2015.09.006.