Факторы, влияющие на получение DH-растений в культуре микроспор in vitro редиса европейского

В последние годы резко повысилась потребность рынка в увеличении производства сортов и гибридов редиса европейского (RaphanussativusL.) для открытого и закрытого грунта, разнообразных по группам спелости, форме и окраске корнеплода. Поэтому важно расширять генетическое разнообразие и ускорять селекционный процесс. Технология получения удвоенных гаплоидов существенно сокращает время при создании гомозиготных константных родительских линий, для получения которых наиболее перспективен метод культуры микроспор invitro. Нам впервые удалось осуществить полный цикл получения DH-растений редиса европейского в культуре микроспор invitro, до включения материала в селекционный процесс. Подобраны: оптимальный размер бутонов, параметры теплового шока, среды для индукции и регенерации. Выявлено, что линейная длина бутонов с оптимальной стадией развития микроспор генотип-специфична. Так, для сортообразца Родос оптимальным является показатель 2.8-3.3 мм, а для сортообразца Тепличный Грибовский -3.7-4.2 мм. Для большинства генотипов оптимален температурный шок 32 °С в течение 48 ч. Впервые для индукции эмбриогенеза использована модифицированная среда Мурасиге-Скуга и обнаружено существенное влияние взаимодействия факторов «генотип x среда» на индукцию эмбриогенеза. Для этапа регенерации растений из эмбриоидов рекомендуется добавление к среде 1 мг/л бензиламинопурина и 0.1 мг/л гиббереллино-вой кислоты, укоренение микропобегов проводится на безгормональной среде. Анализ полученных растений-регенерантов методом подсчета хромосом и методом проточной цитометрии клеточных ядер показал, что 69 % растений имели диплоидный набор хромосом, 9 % - гаплоидный, 22 % - миксоплоидный и анеуплоидный. Семенное потомство удалось получить самоопылением из удвоенных гаплоидов и миксоплоидов, причем все растения R1 имели удвоенный набор хромосом. Это исследование является начальным этапом в разработке эффективной методики получения удвоенных гаплоидов редиса для применения в селекционном процессе.

1. Alexander M.P. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. Stain Technol. 1969;44(3):117-122. DOI 10.3109/10520296909063335.

2. Asif M. Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production. Springer, 2013. DOI 10.1007/978-3-319-00732-8_1.

3. Bhatia R., Dey S.S., Parkash C., Sharma K., Sood S., Kumar R. Modification of important factors for efficient microspore em-bryogenesis and doubled haploid production in field grown white cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) genotypes in India. Sci. Hortic. (Amsterdam). 2018;233:178-187. DOI 10.1016/j.scienta.2018.01.017.

4. Bunin M.S., Shmykova N.A. The Use of Biotechnological Methods to Obtain the Source Material of Cabbage. Moscow: Rosinformagrotekh Publ., 2004. (in Russian)

5. Cao M.Q., Charlot F., Dore C. Embryogenesis and plant regeneration of sauerkraut cabbage (Brassica oleracea L. ssp. capitata) via in vitro isolated microspore culture. C.R. Acad. Sci. Paris. 1990;310:203-209.

6. Chun C., Park H., Na H. Microspore-derived embryo formation in radish (Raphanus sativus L.) according to nutritional and environmental conditions. Hort. Environ. Biotechnol. 2011;52(5):530-535. DOI 10.1007/s13580-011-0080-1.

7. Domblides E.A., Shmykova N.A., Shumilina N.A., Zayachkov-skaya T.V, Mineykina A.I., Kozar E.V, Ahramenko VA., Shevchenko L.L., Kan L.Ju., Bondareva L.L., Domblides A.S. A technology for obtaining doubled haploids in microspore cultures of the Brassicaceae family (guidelines). Moscow: VNIISSOK Publ., 2016. (in Russian)

8. Domblides E.A., Shmykova N.A., Shumilina D.V, Zayachkov-skaya T.V, Vjurtts T.S., Kozar E.V, Kan L.Yu., Romanov VS., Domblides A.S., Pivovarov VF., Soldatenko A.V Biotechnological approaches for breeding programs in vegetable crops. In: VIII Int. Sci. Agric. Symp. “Agrosym 2017”, Jahorina, Bosnia and Herzegovina, Oct. 2017: Book of Proceedings. 2017; 452-460.

9. Duijs J.G., Voorrips R.E., Visser D.L., Custers J.B.M. Microspore culture is successful in most crop types of Brassica oleracea L. Euphytica. 1992;60:45-55. DOI 10.1007/BF00022257.

10. Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol. J. 2010;8:377-424. DOI 10.1111/j.1467-7652.2009.00498.x.

11. Ferrie A.M.R., Caswell K.L. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2011;104:301-309. DOI 10.1007/s11240-010-9800-y.

12. Ferrie A.M.R., Mollers C. Haploids and doubled haploids in Brassica spp. for genetic and genomic research. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2011;104:375-386. DOI 10.1007/s11240-010-9831-4.

13. Forster B.P., Thomas W.T.B. Doubled haploids in genetics and plant breeding. In: Janick J. (Ed.). Plant Breeding Reviews. Vol. 25. John Wiley & Sons, 2005;57-88.

14. Han N., Kim S.U., Park H.Y., Na H. Microspore-derived embryo formation and morphological changes during the isolated microspore culture of radish (Raphanus sativus L.). Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2014;32(3):382-389. DOI 10.7235/hort.2014.13170.

15. Han N., Na H., Kim J. Identification and variation of major aliphatic glucosinolates in doubled haploid lines of radish (Raphanus sativus L.). Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2018;36(2):302-311. DOI 10.12972/kjhst.20180030.

16. Ignatova S.A. Cell Technologies in Crop Production, Genetics and Breeding of Cultivated Plants: Tasks, Opportunities, and Development of in vitro Systems. Odessa: Astroprint Publ., 2011. (in Russian)

17. Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol. 1982;105:427-434. DOI 10.1016/S0044-328X(82)80040-8.

18. Lichter R. Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of different Brassicaceae species. Plant Breed. 1989;103(2):119-123. DOI 10.1111/j.1439-0523.1989.tb00359.x.

19. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (Eds.). Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Springer Science+Business Media, 2003. DOI 10.1007/978-94-017-1293-4.

20. Masuda K., Kikuta Y., Okazawa Y.A. Revision of the medium for somatic embryogenesis in carrot suspension culture. J. Fac. Agric., Hokkaido Univ., Jpn. 1981;60(3):183-193.

21. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and big assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15:473-497. DOI 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.

22. Pechan P.M., Keller W.A. Identification of potentially embryo-genic microspores in Brassica napus. Physiol. Plant. 1988; 74(2):377-384. DOI 10.1111/j.1399-3054.1988.tb00646.x.

23. Pivovarov VF., Bondareva L.L., Shmykova N.A., Shumilina D.V, Mineikina A.I. New generation hybrids of white cabbage (Brassica oleracea L. convar. capitata var. alba DC) based on doubled haploids. Selskokhozyaystvennaya Biolo-giya = Agricultural Biology. 2017;52:143-151. DOI 10.15389/agrobiology.2017.1.143eng.

24. Shmykova N.A., Shumilina D.V, Bondareva L.L., Zablot-skaya E.A. Improvement of DH-technology of development of double haploid plants of broccoli. Selektsiya i Semenovod-stvo Ovoshchnykh Kul’tur = Selection and Seed Farming of Vegetable Crops. 2015;46:601-608. (in Russian)

25. Shumilina D.V, Shmykova N.A., Bondareva L.L., Suprunova T.P. Effect of genotype and medium culture content on microspore-derived embryo formation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis) cv. Lastochka. Biology Bulletin. 2015;42:302-309. DOI 10.1134/S1062359015040135.

26. Takahata Y, Keller W.A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L. Plant Sci. 1991;74:235-242. DOI 10.1016/0168-9452(91)90051-9.

27. Takahata Y., Komatsu H., Kaizuma N. Microspore culture of radish (Raphanus sativus L.): influence of genotype and culture conditions on embryogenesis. Plant Cell Rep. 1996; 16(3-4):163-166. DOI 10.1007/BF01890859.

28. Tuncer B. Callus formation from isolated microspore culture in radish (Raphanus sativus L.). J. Anim. Plant Sci. 2017;27(1):277-282.

29. Vjurtts T.S., Domblides E.A., Shmykova N.A., Fedorova M.I., Kan L. Ju., Domblides A.S. Production of DH-plants in culture of isolated microspore in carrot. Ovoshchi Rossii = Vegetables of Russia. 2017;5(38):25-30. DOI 10.18619/2072-9146-2017-5-25-30. (in Russian)

30. Winarto B., Teixeira da Silva J.A. Microspore culture protocol for Indonesian Brassica oleracea. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2011;107: 305-315. DOI 10.1007/s11240-011-9981-z.

31. Yuan S.X., Su YB., Liu Y.V, Fang Z.Y., Yang L.M., Zhuang M., Zhang YY., Sun PT. Effects of pH, MES, arabinogalactan-proteins on microspore cultures in white cabbage. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2012;110:69-76. DOI 10.1007/s11240-012-0131-z.

32. Zhang W., Qiang F., Xigang D., Manzhu B. The culture of isolated microspores of ornamental kale (Brassica oleracea var. ace-phala) and the importance of genotype to embryo regeneration. Sci. Hortic. (Amsterdam). 2008;117:69-72. DOI 10.1016/j.scienta.2008.03.023.