Оценка in vitro биологической активности отечественного препарата макрофаг-активирующего фактора (GcMAF-RF)

В статье сообщается о разработанном оригинальном способе получения витамин D3-связываю-щего белка (DBP) и его конвертации в макрофаг-активирующий фактор GcMAF-RF. Согласно разработанному регламенту, DBP получали из плазмы крови человека, применяя аффинную колоночную хроматографию, очищали и модифицировали до GcMAF-RF с использованием цитоиммобилизованных гликозидаз (бета-галакто-зидаза и нейраминидаза). Принадлежность полученного полипептида к Gc-группе глобулинов плазмы крови подтверждали вестерн-блотом с использованием специфических антител. Полученный полипептид по своим молекулярным свойствам соответствует описанному в литературе белку GсMAF, находящемуся на стадии клинических испытаний в США, Британии, Израиле и Японии (Saisei Mirai, Reno Integrative Medical Center, Immuno Biotech Ltd, Efranat, Catalytic Longevity). Биологическую активность препарата GcMAF-RF определяли по индукции у перитонеальных макрофагов мыши фагоцитарной активности и способности продуцировать монооксид азота (NO) in vitro. Фагоцитарную активность макрофагов оценивали по эффективности захвата магнитных шариков. Степень активации макрофагов рассчитывали по отношению числа захваченных шариков к общему числу макрофагов. Уровень продукции NO оценивали по накоплению монооксида азота в культуральных супернатантах перитонеальных макрофагов колориметрическим методом с использованием реактива Грисса. Показано, что GcMAF-RF кратно увеличивает фагоцитарную активность макрофагов и достоверно увеличивает продукцию ими монооксида азота. Выделенный оригинальным способом активатор макрофагов GcMAF-RF по своим характеристикам (согласно материалам, опубликованным в печати) соответствует препаратам GcMAF, представляемым на рынке зарубежными компаниями, и может рассматриваться как новый отечественный биологически активный препарат с широким спектром действия. Наибольший интерес вызывает его способность через активацию макрофагов усиливать адаптивный иммунитет организма. В этой связи предполагаются два направления терапевтического применения препарата GcMAF-RF. Препарат может быть востребован в области лечения онкологических заболеваний и, кроме того, может быть использован при лечении ряда нейродегенеративных патологий и иммунодефицитных состояний.

1. Гржибовский А.М. Анализ трех и более независимых групп количественных данных. Экология человека. 2008;3:50-58.

2. Останин А.А., Кирикович С.С., Долгова Е.В., Проскурина А.С., Черных Е.Р., Богачев С.С. Тернистый путь макрофаг-активирующего фактора (GcMAF): от открытия к клинической практике. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2019;23(5):624-631. DOI 10.18699/VJ19.535.

3. Asaoka Y., Ota M., Yoshida K., Sasaki Y., Nishizuka Y. Role of ly-sophosphatidylcholine in T-lymphocyte activation: involvement of phospholipase A2 in signal transduction through protein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992;89(14):6447-6451. DOI 10.1073/pnas.89.14.6447.

4. Borges C.R., Rehder C.R. Glycan structure of Gc protein-derived macrophage activating factor as revealed by mass spectrometry. Arch. Biochem. Biophys. 2016;606:167-179. DOI 10.1016/j.abb.2016.08.006.

5. Cassetta L., Cassol E., Poli G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 2011;11:2391-2402. DOI 10.1100/2011/213962.

6. Delanghe J.R., Speeckaert R., Speeckaert M.M. Behind the scenes of vitamin D binding protein: more than vitamin D binding. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 2015;29(5):773-786. DOI 10.1016/j.beem.2015.06.006.

7. de Souza M.G., Grossi A.L., Pereira E.L., da Cruz C.O., Mendes F.M., Cameron L.C., Paiva C.L. Actin immobilization on chitin for purifying myosin II: a laboratory exercise that integrates concepts of molecular cell biology and protein chemistry. Biochem. Mol. Biol. Educ. 2008;36(1):55-60. DOI 10.1002/bmb.122.

8. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 2003;3(1):23-35. DOI 10.1038/nri978.

9. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J., Skipper P.L., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 1982;126(1):131-138. DOI 10.1016/0003-2697(82)90118-x.

10. Greilberger J., Herwig R. Vitamin D - deglycosylated vitamin D-bind-ing protein dimer: positive synergistic effects on recognition, activation, phagocytosis and oxidative stress on macrophages. Clin. Lab. 2020;66(1):169-177. DOI 10.7754/Clin.Lab.2019.191121.

11. Haddad J.G., Kowalski M.A., Sanger J.W. Actin affinity chromatography in the purification of human, avian and other mammalian plasma proteins binding vitamin D and its metabolites (Gc globulins). Biochem. J. 1984;218(3):805-810. DOI 10.1042/bj2180805.

12. Hammarstrom S., Kabat E.A. Studies on specificity and binding properties of the blood group A reactive hemagglutinin from Helix pomatia. Biochemistry. 1971;10(9):1684-1692. DOI 10.1021/bi00785a028.

13. Inui T., Amitani H., Kubo K., Kuchike D., Uto Y., Nishikata T., Mette M. Case report: a non-small cell lung cancer patient treated with GcMAF, sonodynamic therapy and tumor treating fields. Anticancer Res. 2016a;36:3767-3770. PMID: 27354652.

14. Inui T., Katsuura G., Kubo K., Kuchiike D., Chenery L., Uto Y., Nishikata T., Mette M. Case report: GcMAF treatment in a patient with multiple sclerosis. Anticancer Res. 2016b;36:3771-3774. PMID: 27354653.

15. Inui T., Kuchiike D., Kubo K., Mette M., Uto Y., Hori H., Sakamoto N. Clinical experience of integrative cancer immunotherapy with GcMAF. Anticancer Res. 2013;33(7):2917-2919. PMID: 23780980.

16. Ioannou Y.A., Bishop D.F., Desnick R.J. Overexpression of human alpha-galactosidase A results in its intracellular aggregation, crystallization in lysosomes, and selective secretion. J. Cell Biol. 1992; 119:1137-1150. DOI 10.1083/jcb.119.5.1137.

17. Ishikawa M., Inoue T., Inui T., Kuchiike D., Kubo K., Uto Y., Nishi-kata T. A novel assay system for macrophage-activating factor activity using a human U937 cell line. Anticancer Res. 2014;34(8): 4577-4581. PMID: 25075102.

18. Kisker O., Onizuka S., Becker C.M., Fannon M., Flynn E., D’Amato R., Zetter B., Folkman J., Ray R., Swamy N., Pirie-Shepherd S. Vitamin D binding protein-macrophage activating factor (DBP-maf) inhibits angiogenesis and tumor growth in mice. Neoplasia. 2003; 5(1):32-40. DOI 10.1016/S1476-5586(03)80015-5.

19. Klokol D., Teppone M. Management of metastatic colorectal carcinoma with GcMAF Forte and thymus peptides: a case report. J. Clin. Cell. Immunol. 2016;7:4. DOI 10.4172/2155-9899.1000449.

20. Korbelik M., Naraparaju V.R., Yamamoto N. Macrophage-directed immunotherapy as adjuvant to photodynamic therapy of cancer. Br. J. Cancer. 1997;75(2):202-207. DOI 10.1038/bjc.1997.34.

21. Korbelik M., Naraparaju V.R., Yamamoto N. The value of serum a-N-acetylgalactosaminidase measurement for the assessment of tumour response to radio- and photodynamic therapy. Br. J. Cancer. 1998; 77:1009-1014. DOI 10.1038/bjc.1998.166.

22. Kuchiike D., Uto Y., Mukai H., Ishiyama N., Abe C., Tanaka D., Kawai T., Kubo K., Mette M., Inui T., Endo Y., Hori H. Degalacto-sylated/desialylated human serum containing GcMAF induces macrophage phagocytic activity and in vivo antitumor activity. Anticancer Res. 2013;33(7):2881-2885. PMID: 23780974.

23. Lamagna C., Aurrand-Lions M., Imhof B.A. Dual role of macrophages in tumor growth and angiogenesis. J. Leukoc. Biol. 2006;80(4):705-713. DOI 10.1189/jlb.1105656.

24. Link R.P., Perlman K.L., Pierce E.A., Schnoes H.K., DeLuca H.F. Purification of human serum vitamin D-binding protein by 25-hydro-xyvitamin D3-Sepharose chromatography. Anal. Biochem. 1986; 157(2):262-269. DOI 10.1016/0003-2697(86)90624-x.

25. Malik S., Fu L., Juras D.J., Karmali M., Wong B.Y., Gozdzik A., Cole D.E. Common variants of the vitamin D binding protein gene and adverse health outcomes. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2013;50(1): 1-22. DOI 10.3109/10408363.2012.750262.

26. Matsuura T., Uematsu T., Yamaoka M., Furusawa K. Effect of salivary gland adenocarcinoma cell-derived a-N-acetylgalactosaminidase on the bioactivity of macrophage activating factor. Int. J. Oncol. 2004; 24(3):521-528. DOI 10.3892/ijo.24.3.521.

27. Mohamad S.B., Nagasawa H., Uto Y., Hori H. Preparation of Gc protein-derived macrophage activating factor (GcMAF) and its structural characterization and biological activities. Anticancer Res. 2002; 22(6C):4297-4300. PMID: 12553073.

28. Mosser D.M. The many faces of macrophage activation. J. Leukoc. Biol. 2003;73(2):209-212. DOI 10.1189/jlb.0602325.

29. Moya R., Chan M.K.S., Klokol D., Pan S.Yi. Active specific immunotherapy (ASI) and GcMAF Forte in management of metastatic invasive carcinoma - overview of the therapeutic modalities and a case report. J. Clin. Exp. Immunol. 2018;3(2):1-4.

30. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 2011;11:723-737. DOI 10.1038/nri3073.

31. Nagasawa H., Uto Y., Sasaki H., Okamura N., Murakami A., Kubo S., Kirk K.L., Hori H. Gc protein (vitamin D-binding protein): Gc ge-notyping and GcMAF precursor activity. Anticancer Res. 2005;25: 3689-3696. PMID: 16302727.

32. Naraparaju V.R., Yamamoto N. Roles of P-galactosidase of B lymphocytes and sialidase of T lymphocytes in inflammation-primed activation of macrophages. Immunol. Lett. 1994;43(3):143-148. DOI 10.1016/0165-2478(94)90214-3.

33. Ngwenya B.Z., Yamamoto N. Effects of inflammation products on immune systems. Lysophosphatidylcholine stimulates macrophages. Cancer Immunol. Immunother. 1986;21(3):174-182. DOI 10.1007/bf00199358.

34. Pacini S., Punzi T., Morucci G., Gulisano M., Ruggiero M. Effects of vitamin D-binding protein-derived macrophage-activating factor on human breast cancer cells. Anticancer Res. 2012;32(1):45-52. PMID: 22213287.

35. Paduraru D.N., Bouariu A., Ion D., Andronic O., Dumitrascu M.C., Bolocan A. Considerations regarding GcMAF treatement in breast cancer. Rom. Biotechnol. Lett. 2019;24(5):851-855. DOI 10.25083/rbl/24.5/851.855.

36. Rehder D.S., Nelson R.W., Borges C.R. Glycosylation status of vitamin D binding protein in cancer patients. Protein Sci. 2009;18(10): 2036-2042. DOI 10.1002/pro.214.

37. Ruggiero M., Reinwald H., Pacini S. Is chondroitin sulfate responsible for the biological effect attributed to the GC protein-derived Macrophage Activating Factor (GcMAF)? Med. Hypotheses. 2016;94: 126-131. DOI 10.1016/j.mehy.2016.07.012.

38. Ruggiero M., Ward E., Smith R., Branca J.J., Noakes D., Morucci G., Taubmann M., Thyer L., Pacini S. Oleic acid, deglycosylated vitamin D-binding protein, nitric oxide: a molecular triad made lethal to cancer. Anticancer Res. 2014;34(7):3569-3578. PMID: 24982371.

39. Saburi E., Saburi A., Ghanei M. Promising role for Gc-MAF in cancer immunotherapy: from bench to bedside. Caspian J. Intern. Med. 2017a;8(4):228-238. DOI 10.22088/cjim.8.4.228.

40. Saburi E., Tavakol-Afshari J., Biglari S., Mortazavi Y. Is a-N-acetyl-galactosaminidase the key to curing cancer? A mini-review and hypothesis. JBUON. 2017b;22(6):1372-1377. PMID: 29332325.

41. Sica A., Bronte V. Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in tumor development. J. Clin. Invest. 2007;117(5):1155-1166. DOI 10.1172/JCI31422.

42. Smith R., Thyer L., Ward E., Meacci E., Branca J.J.V., Morucci G., Gu-lisano M., Ruggiero M., Pacini A., Paternostro F., Mannelli L.D.C., Noakes D.J., Pacini S. Effects of Gc-macrophage activating factor in human neurons; implications for treatment of chronic fatigue syndrome. Am. J. Immunol. 2013;9(4):120-129. DOI 10.3844/ajisp.2013.120.129.

43. Spudich J.A., Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. J. Biol. Chem. 1971;246(15):4866-4871. PMID: 4254541.

44. Swamy N., Ray R. 25-Hydroxy[26,27-methyl-3H]vitamin D3-3P-(1,2-epoxypropyl)ether: an affinity labeling reagent for human vitamin D-binding protein. Arch. Biochem. Biophys. 1995;319(2):504-507. DOI 10.1006/abbi.1995.1323.

45. Thyer L., Ward E., Smith R., Branca J.J., Morucci G., Gulisano M., Noakes D., Eslinger R., Pacini S. GC protein-derived macrophageactivating factor decreases a-N-acetylgalactosaminidase levels in advanced cancer patients. Oncoimmunology. 2013a;2(8):e25769. DOI 10.4161/onci.25769.

46. Thyer L., Ward E., Smith R., Fiore M.G., Magherini S., Branca J.J., Morucci G., Gulisano M., Ruggiero M., Pacini S. A novel role for a major component of the vitamin D axis: vitamin D binding protein-derived macrophage activating factor induces human breast cancer cell apoptosis through stimulation of macrophages. Nutrients. 2013b;5(7):2577-2589. DOI 10.3390/nu5072577.

47. Toyohara Y., Hashitani S., Kishimoto H., Noguchi K., Yamamoto N., Urade M. Inhibitory effect of vitamin D-binding protein-derived macrophage activating factor on DMBA-induced hamster cheek pouch carcinogenesis and its derived carcinoma cell line. Oncol. Lett. 2011;2(4):685-691. DOI 10.3892/ol.2011.306.

48. Ugarte A., Bouche G., Meheus L. Inconsistencies and questionable reliability of the publication “Immunotherapy of metastatic colorectal cancer with vitamin D-binding protein-derived macrophages-acti-vating, GcMAF” by Yamamoto et al. Cancer Immunol. Immunother. 2014;63(12):1347-1348. DOI 10.1007/s0262-014-1587-y.

49. Yamamoto N. Structural definition of a potent macrophage activating factor derived from vitamin D3-binding protein with adjuvant activity for antibody production. Mol. Immunol. 1996;33:1157-1164. PMID: 8360493.

50. Yamamoto N., Homma S. Vitamin D3 binding protein (group-specific component) is a precursor for the macrophage-activating signal factor from lysophosphatidylcholine-treated lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991;88(19):8539-8543. DOI 10.1073/pnas. 88.19.8539.

51. Yamamoto N., Kumashiro R. Conversion of vitamin D3 binding protein (group-specific component) to a macrophage activating factor by the stepwise action of beta-galactosidase of B cells and sialidase of T cells. J. Immunol. 1993;151(5):2794-2802. PMID: 8360493.

52. Yamamoto N., Naraparaju V.R., Asbell S.O. Deglycosylation of serum vitamin D3-binding protein leads to immunosuppression in cancer patients. Cancer Res. 1996;56(12):2827-2831. PMID: 8665521.

53. Yamamoto N., Suyama H., Yamamoto N. Immunotherapy for prostate cancer with Gc protein-derived macrophage-activating factor, GcMAF. Transl. Oncol. 2008;1(2):65-72. DOI 10.1593/tlo.08106.