Адаптация сульфофосфованилинового метода анализа общих липидов для различных биологических объектов на примере Drosophila melanogaster

Липидный обмен имеет решающее значение в физиологии. В последние десятилетия модельный объект Drosophila melanogaster активно используется в изучении фундаментальных вопросов метаболизма липидов и его нарушений, включая ожирение, а также в поиске терапевтических целей для лечения метаболических нарушений у человека. Быстрое и точное количественное определение содержания липидов – важный шаг в решении этих задач. Впервые метод количественного измерения общих липидов с использованием сульфофосфованилинового (СФВ) метода был описан Цольнером с коллегами в 1962 г., а адаптирован для насекомых Ван Генделем на самках желтолихорадочного комара Aedes aegypti. Преимущество этого метода по сравнению с традиционными гравиметрическим и хроматографическим методами анализа заключается в том, что он позволяет обходиться минимальным количеством биологического материала, не требует сложных манипуляций с образцом, является высокочувствительным, воспроизводимым и простым в реализации с минимальным набором оборудования. В настоящей работе описана модификация протокола Ван Генделя, позволяющая осуществлять адаптацию метода количественного определения общих липидов для различных организмов, на примере классической биологической модели D. melanogaster. В представленном протоколе адаптированы время реакции, объемы химических растворов и реагентов для проведения анализа образцов индивидуальных дрозофил. Данная работа является актуальной, так как описывает универсальную схему, согласно которой СФВ метод может быть адаптирован для количественного анализа содержания общих липидов у широкого спектра биологических объектов. Для проверки результативности модифицированного метода мы измерили содержание общих липидов у самок D. melanogaster, несущих гипоморфные мутации генов инсулинового сигнального каскада dilp6 и dfoxo, по сравнению с линией дикого типа Canton-S и показали участие dilp6, но не dfoxo в регуляции жирового обмена. Полученные результаты подчеркивают эффективность колориметрического метода с использованием СФВ реакции и спектрофотометрии для количественного анализа содержания общих липидов.

Drosophila melanogaster, сульфофосфованилиновый метод, колориметрия, спектрофотометрия, общие липиды, жировой обмен, мутации dilp⁶⁴¹ и dfoxo^BG01018

1. Еремина М.А., Карпова Е.К., Раушенбах И.Ю., Пирожкова Д.С., Андреенкова О.В., Грунтенко Н.Е. Влияние мутаций генов инсулинового сигнального каскада на изменение уровня углеводов у самок Drosophila melanogaster при тепловом стрессе. Генетика. 2019;55(4):485-488. DOI 10.1134/S0016675819030068.

2. Ростовцев В.Р., Резник Г.Е. Количественное определение липидных фракций в крови. Лаб. дело. 1982;4:26-29.

3. Abdullah S., Davies S., Wall R. Spectrophotometric analysis of lipid used to examine the phenology of the tick Ixodes ricinus. Parasit Vectors. 2018;11:523. DOI 10.1186/s130-71-018-3102-3.

4. Al-Anzi B., Zinn K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 2010;5(8):e12353. DOI 10.1371/journal.pone.0012353.

5. Álvarez-Rendón J.P., Salceda R., Riesgo-Escovar J.R. Drosophila melanogaster as a model for diabetes type 2 progression. BioMed. Res. Int. 2018;2018:1417528. DOI 10.1155/2018/1417528.

6. Anschau А., Caruso C.S., Kuhn R.C., Franco T.T. Validation of the sulfo-phospho-vanillin (spv) method for the determination of lipid content in oleaginous microorganisms. Braz. J. Chem. Eng. 2017; 34(1):19-27. DOI 10.1590/0104-6632.20170341s20140222.

7. Bozdoğan H., Erbey M., Aksoy H.A. Total amount of protein, lipid and carbohydrate of some adult species belong to curculionidae family (Coleoptera: Curculionidae). J. Entomol. Zool. Stud. 2016;4(5):242-248.

8. Byreddy A.R., Gupta A., Barrow C.J., Puri M. A quick colorimetric method for total lipid quantification in microalgae. J. Microbiol. Meth. 2016;125:28-32.

9. Cheng Y.S., Zheng Y., VanderGheynst J.S. Rapid quantitative analysis of lipids using a colorimetric method in a microplate format. Lipids. 2011;46(1):95-103. DOI 10.1007/s11745-010-3494-0.

10. Dionne M.S., Pham L.N., Shirasu-Hiza M., Schneider D.S. Akt and FOXO dysregulation contribute to infection-induced wasting in Drosophila. Curr. Biol. 2006;16:1977-1985.

11. Foray V., Pelisson P.-F., Venner M.C.B., Desouhant E., Venner S., Menu F., Giron D., Rey B. A handbook for uncovering the complete energetic budget in insects: the van Handel’s method (1985) revisited. Physiol. Entomol. 2012;37:295-302. DOI 10.1111/j.13653032.2012.00831.x.

12. Fukumura K., Konuma T., Tsukamoto Y., Nagata S. Adipokinetic hormone signaling determines dietary fatty acid preference through maintenance of hemolymph fatty acid composition in the cricket Gryllus bimaculatus. Sci. Rep. 2018;8:4737. DOI 10.1038/s41598018-22987-2.

13. Gontijo A.M., Garelli A. The biology and evolution of the Dilp8Lgr3 pathway: a relaxin-like pathway coupling tissue growth and developmental timing control. Mech. Dev. 2018;154:44-50. DOI 10.1016/j.mod.2018.04.005.

14. Gruntenko N.E., Adonyeva N.V., Burdina E.V., Karpova E.K., Andreenkova O.V., Gladkikh D.V., Ilinsky Y.Y., Rauschenbach I.Yu. The impact of FOXO on dopamine and octopamine metabolism in Drosophila under normal and heat stress conditions. Biol. Open. 2016;5:1706-1711. DOI 10.1242/bio.022038.

15. Gruntenko N.E., Rauschenbach I.Y. The role of insulin signalling in the endocrine stress response in Drosophila melanogaster: a minireview. Gen. Comp. Endocrinol. 2018;258:134-139. DOI 10.1016/j.ygcen.2017.05.019.

16. Hildebrandt A., Bickmeyer I., Kühnlein R.P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 2011; 6(9):e23796. DOI 10.1371/journal.pone.0023796.

17. Kleinert M., Clemmensen C., Hofmann S.M., Moore M.C., Renner S., Woods S.C., Huypens P., Beckers J., de Angelis M.H., Schürmann A., Bakhti M., Klingenspor M., Heiman M., Cherrington A.D., Ristow M., Lickert H., Wolf E., Havel P.J., Müller T.D., Tschöp M.H. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat. Rev. Endocrinol. 2018;14(3):140-162. DOI 10.1038/nrendo.2017.161.

18. Knight J.A., Anderson S., Rawle J.M. Chemical basis of the sulfo-phospho-vanillin reaction for estimating total serum lipids. Clin. Chem. 1972;18(3):199-202.

19. Lee C.L. What we can learn from the energetic levels of insects: a guide and review. Ann. Entomol. Soc. Am. 2019;112(3):220-226. DOI 10.1093/aesa/say051.

20. Liu Z., Huang X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). 2013;45(1):44-50. DOI 10.1093/abbs/gms105.

21. Lu Y., Ludsin S.A., Fanslow D.L., Pothoven S.A. Comparison of three microquantity techniques for measuring total lipids in fish. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 2008;65:2233-2241. DOI 10.1139/F08-135.

22. Murillo-Maldonado J.M., Sánchez-Chávez G., Salgado L.M., Salceda R., Riesgo-Escovar J.R. Drosophila insulin pathway mutants affect visual physiology and brain function besides growth, lipid, and carbohydrate metabolism. Diabetes. 2011;60(5):1632-1636. DOI 10.2337/db10-1288.

23. Musselman L.P., Kühnlein R.P. Drosophila as a model to study obesity and metabolic disease. J. Exp. Biol. 2018;221(Suppl.1):jeb163881. DOI 10.1242/jeb.163881.

24. Park J., Jeong H.J., Yoon E.Y., Moon S.J. Easy and rapid quantification of lipid contents of marine dinoflagellates using the sulpho-phosphovanillin method. Algae. 2016;31(4):391-401. DOI 10.4490/algae.2016.31.12.7.

25. Patel A., Antonopoulou I., Enman J., Rova U., Christakopoulos P., Matsakas L. Lipids detection and quantification in oleaginous microorganisms: an overview of the current state of the art. BMC Chem. Eng. 2019;1:13. DOI 10.1186/s42480-019-0013-9.

26. Rauschenbach I.Yu., Karpova E.K., Burdina E.V., Adonyeva N.V., Bykov R.A., Ilinsky Y.Y., Menshanov P.N., Gruntenko N.E. Insulinlike peptide DILP6 regulates juvenile hormone and dopamine metabolism in Drosophila females. Gen. Comp. Endocrinol. 2016;243: 1-9. DOI 10.1016/j.ygcen.2016.11.0040016-6480.

27. Tennessen J.M., Barry W.E., Cox J., Thummel C.S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 2014;68(1):105-115. DOI 10.1016/j.ymeth.2014.02.034.

28. Trinh I., Boulianne G.L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology. 2013;28:117-124. DOI 10.1152/physiol.00025.2012.

29. Van Handel E. Rapid determination of total lipids in mosquitoes. J. Am. Mosq. Control Assoc. 1985;1:302-304.