Апробация различных вариантов RNA-seq для идентификации аутронов генов у плоского червя Opisthorchis felineus

Opisthorchis felineus – представитель паразитических плоских червей, один из возбудителей описторхоза человека. Недавно нами была проведена сборка генома O. felineus, однако корректная аннотация генов в этом геноме стандартными методами оказалась затруднена наличием сплайс-лидер зависимого транс-сплайсинга (SLTS). В результате SLTS исходный 5’-конец (аутрон) транскриптов заменяется короткой сплайс-лидерной последовательностью, донором которой выступает специализированная молекула SL РНК. SLTS вовлечен в процессинг РНК более половины всех генов O. felineus, из-за чего становится невозможным установить последовательности аутронов и реальные старты транскрипции соответствующих генов и оперонов, опираясь только на данные mRNA-seq. В настоящей работе мы провели апробацию различных экспериментальных подходов для идентификации последовательностей аутронов у O. felineus с помощью массового параллельного секвенирования. Два подхода были спланированы нами для прицельного секвенирования процессированных разветвленных аутронов. Первый заключался в сиквенс-специфичной обратной транскрипции с SL-интрона в направлении 5’-конца аутрона. Во втором использовалась гибридизация аутронов с иммобилизованным одноцепочечным ДНК-зондом, комплементарным SL-интрону. Также были использованы два подхода к секвенированию тотальной РНК, обедненной по рРНК, позволяющих идентифицировать более широкий спектр транскриптов, чем mRNA-seq. Один из них основан на ферментативной элиминации перепредставленных кДНК, другой  – на ферментативной деградации некэпированных РНК экзонуклеазой Terminator. С помощью селективных методов нам не удалось получить обогащения препаратов РНК по процессированным аутронам, что, наиболее вероятно, связано с коротким временем жизни этих промежуточных продуктов транс-сплайсинга. Из двух методов обеднения по рРНК высокую эффективность показал метод, основанный на ферментативной нормализации кДНК (Zymo-Seq RiboFree). Он позволил примерно вдвое увеличить долю прочтений, соответствующих аутронам и интронам, по сравнению с mRNA-seq. Полученные результаты предполагают, что основным ресурсом последовательностей аутронов в пуле РНК O. felineus служат новосинтезированные непроцессированные транскрипты.

1. Beer S.A. Biology of the Agent of Opisthorchiasis. Moscow, 2005. (in Russian)

2. Bitton D.A., Rallis C., Jeffares D.C., Smith G.C., Chen Y.Y.C., Codlin S., Marguerat S., Bähler J. LaSSO, a strategy for genome-wide mapping of intronic lariats and branch points using RNA-seq. Genome Res. 2014;24(7):1169-1179. DOI 10.1101/gr.166819.113.

3. Boroni M., Sammeth M., Gava S.G., Jorge N.A.N., Macedo A.M., Machado C.R., Mourão M.M., Franco G.R. Landscape of the spliced leader trans-splicing mechanism in Schistosoma mansoni. Sci. Rep. 2018;8(1):3877. DOI 10.1038/s41598-018-22093-3.

4. Chen R.A.-J., Down T.A., Stempor P., Chen Q.B., Egelhofer T.A., Hillier L.W., Jeffers T.E., Ahringer J. The landscape of RNA polymerase II transcription initiation in C. elegans reveals promoter and enhancer architectures. Genome Res. 2013;23(8):1339-1347. DOI 10.1101/gr.153668.112.

5. Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F., Drenkow J., Zaleski C., Jha S., Batut P., Chaisson M., Gingeras T.R. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29(1):15-21. DOI 10.1093/bioinformatics/bts635.

6. Döring J., Hurek T. Arm-specific cleavage and mutation during reverse transcription of 2′,5′-branched RNA by Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase. Nucleic Acids Res. 2017;45(7):39673984. DOI 10.1093/nar/gkx073.

7. Ershov N.I. Evaluation of various RNA-seq approaches for identification of outrons in the flatworm Opisthorchis felineus (Version 1.0.0). Zenodo. 2020. DOI 10.5281/zenodo.3901531.

8. Ershov N.I., Mordvinov V.A., Prokhortchouk E.B., Pakharukova M.Y., Gunbin K.V., Ustyantsev K., Genaev M.A., Blinov A.G., Mazur A., Boulygina E., Tsygankova S., Khrameeva E., Chekanov N., Fan G., Xiao A., Zhang H., Xu X., Yang H., Solovyev V., Lee S.M., Liu X., Afonnikov D.A., Skryabin K.G. New insights from Opisthorchis felineus genome: update on genomics of the epidemiologically important liver flukes. BMC Genom. 2019;20(1):399. DOI 10.1186/s12864-019-5752-8.

9. FAO/WHO [Food and Agriculture Organization of the United Nations/ World Health Organization]. Multicriteria-Based Ranking for Risk Management of Food-Borne Parasites. Microbiological Risk Assessment Series. No. 23. Rome, 2014.

10. Fedorova O.S., Fedotova M.M., Sokolova T.S., Golovach E.A., Kovshirina Y.V., Ageeva T.S., Kovshirina A.E., Kobyakova O.S., Ogorodova L.M., Odermatt P. Opisthorchis felineus infection prevalence in Western Siberia: a review of Russian literature. Acta Trop. 2018; 178:196-204. DOI 10.1016/j.actatropica.2017.11.018.

11. Hannon G.J., Maroney P.A., Denker J.A., Nilsen T.W. Trans splicing of nematode pre-messenger RNA in vitro. Cell. 1990;61(7):1247-1255. DOI 10.1016/0092-8674(90)90689-c.

12. Ishikawa H. Evolution of ribosomal RNA. Comp. Biochem. Physiol. 1977;58(1):1-7. DOI 10.1016/0305-0491(77)90116-X.

13. Kruesi W.S., Core L.J., Waters C.T., Lis J.T., Meyer B.J. Condensin controls recruitment of RNA polymerase II to achieve nematode X-chromosome dosage compensation. eLife. 2013;2:e00808. DOI 10.7554/eLife.00808.

14. Lagesen K., Hallin P., Rødland E.A., Staerfeldt H.H., Rognes T., Ussery D.W. RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res. 2007;35(9):3100-3108. DOI 10.1093/nar/gkm160.

15. Lasda E.L., Blumenthal T. Trans-splicing. Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2011;2(3):417-434. DOI 10.1002/wrna.71.

16. Liao Y., Smyth G.K., Shi W. The R package Rsubread is easier, faster, cheaper and better for alignment and quantification of RNA sequencing reads. Nucleic Acids Res. 2019;47(8):e47. DOI 10.1093/nar/gkz114.

17. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 2011;17(1):10-12. DOI 10.14806/ej.17.1.200.

18. Murphy W.J., Watkins K.P., Agabian N. Identification of a novel Y branch structure as an intermediate in trypanosome mRNA processing: evidence for trans-splicing. Cell. 1986;47:517-525. DOI 10.1016/0092-8674(86)90616-1.

19. Nilsson D., Gunasekera K., Mani J., Osteras M., Farinelli L., Baerlocher L., Roditi I., Ochsenreiter T. Spliced leader trapping reveals widespread alternative splicing patterns in the highly dynamic transcriptome of Trypanosoma brucei. PLoS Pathog. 2010;6(8): e1001037. DOI 10.1371/journal.ppat.1001037.

20. Pakharukova M.Y., Mordvinov V.A. The liver fluke Opisthorchis felineus: biology, epidemiology, and carcinogenic potential. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2016;110:28-36. DOI 10.1093/trstmh/trv085.

21. Pakharukova M.Y., Zaparina O.G., Kapushchak Y.K., Baginskaya N.V., Mordvinov V.A. Opisthorchis felineus infection provokes time-dependent accumulation of oxidative hepatobiliary lesions in the injured hamster liver. PLoS One. 2019;14(5):e0216757. DOI 10.1371/journal.pone.0216757.

22. Saito T.L., Hashimoto S., Gu S.G., Morton J.J., Stadler M., Blumenthal T., Fire A., Morishita S. The transcription start site landscape of C. elegans. Genome Res. 2013;23(8):1348-1361. DOI 10.1101/gr.151571.112.

23. Sripa B., Kaewkes S., Sithithaworn P., Mairiang E., Laha T., Smout M., Pairojkul C., Bhudhisawasdi V., Tesana S., Thinkamrop B., Bethony J.M., Loukas A., Brindley P.J. Liver fluke induces cholangiocarcinoma. PLoS Med. 2007;4(7):e201. DOI 10.1371/journal.pmed.0040201.

24. Sutton R.E., Boothroyd J.C. Trypanosome trans-splicing utilizes 2′5′ branches and a corresponding debranching activity. EMBO J. 1988;7(5):1431-1437.