Транспластомные растения табака, продуцирующие гидрофильный домен белка оболочки L1R вируса оспы овец

Оспа овец имеет широкий географический ареал и представляет угрозу овцеводству во всем мире, так как заболевание высококонтагиозное и сопровождается большими экономическими потерями. В  настоящее время для профилактики этого заболевания применяются вакцины на основе живых аттенуированных штаммов вируса. Подобные вакцины эффективны, однако потенциально опасны из-за возможной реверсии вируса к патогенному состоянию, поэтому весьма актуально создание безопасных рекомбинантных субъединичных вакцин против оспы овец. Известно, что хлоропласты растений в силу своей полиплоидности могут нарабатывать чужеродные белки в больших количествах. Целью данного исследования было получение транспластомных растений табака Nicotiana tabacum, синтезирующих один из кандидатных вакцинных белков вируса оспы овец L1R. Для проведения генетической трансформации хлоропластов создана конструкция, обеспечивающая интеграцию делеционного варианта гена SPPV_56, кодирующего N-концевую гидрофильную часть оболочечного белка L1R, в межгенную область trnG/trnfM хлоропластного генома табака путем гомологичной рекомбинации. Методом биобаллистики с помощью «генной пушки» получены линии табака, устойчивые к селективному антибиотику спектиномицину. ПЦР-анализ в присутствии ген-специфичных праймеров подтвердил интеграцию целевой вставки в растительный геном. Последующие нозерн- и вестернблот анализы препаратов РНК и белковых экстрактов из полученных растений показали экспрессию целевого гена на транскрипционном и трансляционном уровне. Содержание рекомбинантного белка составило ~0.9 % от общего растворимого белка. Несмотря на задержку роста и более бледную окраску листьев по сравнению с растениями дикого типа, транспластомные растения нормально развивались и завязывали семена. Оценка гомопластидности методом Саузерна выявила гетерогенность пластидных геномов полученных растений, обусловленную генетической рекомбинацией между эндогенными и привнесенными в составе конструкции хлоропластными регуляторными ДНК-последовательностями. Методом металл-аффинной хроматографии была проведена очистка рекомбинантного белка из растительной ткани. В дальнейшем планируется изучить способность продуцируемого хлоропластами белка индуцировать вируснейтрализующие антитела против штаммов вируса оспы овец.

1. Beisenov D.K., Argimbaeva T.U., Stanbekova G.E., Iskakov B.K. Synthesis of the immunogenic domain of the L1R protein of sheep pox in rapeseed. Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya = Veterinary, Zootechnics and Biotechnology. 2019;8:45-54. (in Russian)

2. Beisenov D., Stanbekova G., Nadirova L., Iskakov B. Sheep pox viral envelope protein L1RΔ synthesis in plants. Vestnik KazNU. Seriya Biologicheskaya = KazNU Bulletin. Biology series. 2014;60: 187- 190. (in Russian)

3. Bisht H., Weisberg A.S., Moss B. Vaccinia virus L1 protein is required for cell entry and membrane fusion. J. Virol. 2008;82:8687-8694. DOI 10.1128/JVI.00852-08.

4. Bock R. Engineering chloroplasts for high-level foreign protein expression. Methods Mol. Biol. 2014;1132:93-106. DOI 10.1007/978-1-62703-995-6_5.

5. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 1976;72:248-254.

6. Chervyakova O.V., Zaitsev V.L., Iskakov B.K., Tailakova E.T., Strochkov V.M., Sultankulova K.T., Sandybayev N.T., Stanbekova G.E., Beisenov D.K., Abduraimov Y.O., Mambetaliyev M., Sansyzbay A.R., Kovalskaya N.Y., Nemchinov L.G., Hammond R.W. Recombinant sheep pox virus proteins elicit neutralizing antibodies. Viruses. 2016;8:159-171. DOI 10.3390/v8060159.

7. Clarke J.L., Daniell H. Plastid biotechnology for crop production: present status and future perspectives. Plant Mol. Biol. 2011;77:203. DOI 10.1007/s11103-011-9767-z.

8. Daniell H., Rai V., Xiao Y. Cold chain and virus-free oral polio booster vaccine made in lettuce chloroplasts confers protection against all three poliovirus serotypes. Plant Biotechnol. J. 2019;17:1357-1368. DOI 10.1111/pbi.13060.

9. Demain A.L., Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol. Adv. 2009;27:297-306. DOI 10.1016/j.biotechadv.2009.01.008.

10. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! Nat. Biotechnol. 1994;12:883-887.

11. Gray B.N., Ahner B.A., Hanson M.R. Extensive homologous recombination between introduced and native regulatory plastid DNA elements in transplastomic plants. Transgenic Res. 2009;18:559-572. DOI 10.1007/s11248-009-9246-3.

12. Kurchenko F.P., Ivanyushchenkov V.N., Ufimtsev K.P. The effectiveness of dry culture vaccinia virus from the NISKHI strain against sheep pox. Veterinariya = Veterinary Medicine. 1991;10:21-24. (in Russian)

13. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-685.

14. Lenzi P., Scotti N., Alagna F., Tornesello M.L., Pompa A., Vitale A., De Stradis A., Monti L., Grillo S., Buonaguro F.M., Maliga P., Cardi T. Translational fusion of chloroplast-expressed human papillomavirus type 16 L1 capsid protein enhances antigen accumulation in transplastomic tobacco. Transgenic Res. 2008;17:1091-1102. DOI 10.1007/s11248-008-9186-3.

15. McAleer W.J., Buynak E.B., Maigetter R.Z., Wampler D.E., Miller W.J., Hilleman M.R. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Nature. 1984;307:178-180. DOI 10.1038/307178a0.

16. McCabe M.S., Klaas M., Gonzalez-Rabade N., Poage M., BadilloCorona J.A., Zhou F., Karcher D., Bock R., Gray J.C., Dix P.H. Plastid transformation of high-biomass tobacco variety Maryland Mammoth for production of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) p24 antigen. Plant Biotechnol. J. 2008;6:914-929. DOI 10.1111/j.1467-7652.2008.00365.x.

17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962;15:473- 497.

18. Oey M., Lohse M., Kreikemeyer B., Bock R. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic. Plant J. 2009;57:436-445. DOI 10.1111/j.1365-313X.2008.03702.x.

19. Rigano M.M., Manna C., Giulini A., Pedrazzini E., Capobianchi M., Castilletti C., Di Caro A., Ippolito G., Beggio P., De Giuli Morghen C., Monti L., Vitale A., Cardi T. Transgenic chloroplasts are efficient sites for high-yield production of the vaccinia virus envelope protein A27L in plant cells. Plant Biotechnol. J. 2009;7:577-591. DOI 10.1111/j.1467-7652.2009.00425.x.

20. Saba K., Gottschamel J., Younus I., Syed T., Gull K., Lössl A.G., Mirza B., Waheed M.T. Chloroplast-based inducible expression of ESAT-6 antigen for development of a plant-based vaccine against tuberculosis. J. Biotechnol. 2019;305:1-10. DOI 10.1016/j.jbiotec.2019.08.016.

21. Shchelkunov S.N., Konstantinov Yu.M., Deineko E.V. Transplastome plants. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2011;15(4):808-817. (in Russian)

22. Svab Z., Hajdukiewicz P., Maliga P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990;87:8526-8530. DOI 10.1073/pnas.87.21.8526.

23. Tulman E.R., Afonso C.L., Lu Z., Zsak L., Sur J.H., Sandybaev N.T., Kerembekova U.Z., Zaitsev V.L., Kutish G.F., Rock D.L. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. J. Virol. 2002;76:6054- 6061. DOI 10.1128/JVI.76.12.6054-6061.2002.

24. van Eerde A., Gottschamel J., Bock R., Hansen K.E.A., Munangándu H.M., Daniell H., Liu Clarke J. Production of tetravalent dengue virus envelope protein domain III based antigens in lettuce chloroplasts and immunologic analysis for future oral vaccine development. Plant Biotechnol. J. 2019;17:1408-1417. DOI 10.1111/pbi.13065.

25. Zhou F., Badillo-Corona J., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.M., Maloney A.P., Kavanagh T.A., Gray J.C., Bock R. High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes. Plant Biotechnol. J. 2008;6:897-913. DOI 10.1111/j.1467-7652.2008.00356.x.

26. Zhou F., Karcher D., Bock R. Identification of a plastid intercistronic expression element (IEE) facilitating the expression of stable translatable monocistronic mRNAs from operons. Plant J. 2007;52:961- 972. DOI 10.1111/j.1365-313X.2007.03261.x.