Галофильные бактерии соленых озер и солончаковых почв Прикаспийской низменности (Республика Дагестан) и их биотехнологический потенциал

Приведены результаты изучения биоразнообразия и биотехнологического потенциала галофильных микроорганизмов из термального высокоминерализованного Берикейского озера, соленого Тарумовского озера и солончаковых почв Прикаспийской низменности (Республика Дагестан). С использованием микробиологических методов и метода анализа генов 16S рРНК идентифицированы денитрифицирующие галофильные бактерии родов Halomonas и Virgibacillus. Выявлен новый вид Halomonas sp. G2 (MW386470) с 95 % уровнем сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Штамм G2 – экстремальный галофил, способный расти в диапазоне 5–25 % NaCl (оптимум 25 %) и образовывать каротиноидный пигмент. Мезофил (30–37 °С, оптимум 30 °С), нейтрофил (рН 6–8, оптимум 7.2–7.4). Хемолитотроф; редуцирует нитрат или нитрит в качестве доноров электронов; каталазо-, амилазо-, протеазо- и β-галактозидазоположительный; липазо-, оксидазо- и уреазоотрицательный. Не способен гидролизовать инозит, индол; продуцирует лизин, желатин, эктоин; в качестве источника углерода и энергии использует цитрат и малат натрия; не продуцирует орнитин, H₂S и кислоту из d-маннозы, сахарозы, глицерина, целлобиозы, кроме лактозы и d-глюкозы. Восприимчив к триметоприму, ципрофлоксацину, офлоксацину, канамицину, ванкомицину, рифампицину, цефуроксиму, ампициллину, цефтазидиму, фосфомицину, кларитромицину, цефепиму, цефаклору. Содержание G+C в ДНК 67.3 %. Отличительной характеристикой изолята являлось продуцирование промышленно значимых гидролитических ферментов, таких как амилаза, протеаза, β-галактозидаза и оксиредуктазы – каталазы при концентрации NaCl в среде 25 %. Местообитание: солончаковые почвы на территории Терско-Кумской низменности (Республика Дагестан, Россия). Остальные галофильные изоляты H. ventosae G1 (MW386469), H. elongata G3 (MW386471), V. salinarius B2 (MW386472) и V. salinarius B3 (MW386473) имели высокую степень сходства (100 %) с типовыми штаммами H. elongata DSM 2581^Т и V. salarius DSM 18441^Т; содержание G+C в ДНК составляло 65.8, 66.5, 42.8 и 37.3 % соответственно. Штаммы имели высокий биотехнологический потенциал при концентрации NaCl в среде 5 и 25 %. Полученные данные расширили представление о разнообразии и экологическом значении денитрифицирующих бактерий в функционировании засушливых экосистем и выявлении штаммов, продуцирующих ферменты промышленного значения.

1. Banciu H.L., Enach M., Rodriguez R.M., Oren A., Ventosa A. Ecology and physiology of halophilic microorganisms – Thematic issue based on papers presented at Halophiles 2019 – 12th International Conference on Halophilic Microorganisms, Cluj-Napoca, Romania, 24–28 June, 2019. FEMS Microbiol. Lett. 2020;366(23):1-4. DOI 10.1093/femsle/fnz250.

2. Вaumann P., Baumann L. The marine gram-negative Eubacteria. In: Starr M.P., Stolp H., Trüper H.G., Balows A., Schlegel H.G. (Eds.). The Prokaryotes. A handbook on habitats, isolation nd identification of bacteria. Berlin: Springer-Verlag, 1986;2:1302-1331.

3. Begmatov Sh.A., Selitskaya O.V., Vasileva L.V., Berestovskaja Yu.Yu., Manucharova N.A., Drenova N.V. Morphophysiological features of some cultivable bacteria from saline soils of the Aral Sea region. Eur. J. Soil Sci. 2020;53(1):90-96. DOI 10.1134/S1064229320010044.

4. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979; 7(6):1513-1523.

5. Bonch-Osmolovskaya E.A., Atomi H. Editorial overview: Extremophiles: from extreme environments to highly stable catalysts. Curr. Opin. Microbiol. 2015;25:88-96.

6. Bulygina E.S., Kuznetsov B.B., Marusina A.I., Kravchenko I.K., Bykova S.A., Kolganova T.V., Galchenko V.F. Study of nucleotide sequences of nif H genes in methanotrophic bacteria. Mikrobiologiya = Microbiology. 2002;71(4):425-432.

7. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden T.L. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinform. 2009;10(421):1-9. DOI 10.1186/1471-2105-10-421.

8. Chernousova E.Yu., Akimov V.N., Gridneva E.V., Dubinina G.A., Grabovich M.Yu. Phylogenetic in situ/ex situ analysis of a sulfur mat microbial community from a thermal sulfide spring in the North Caucasus. Mikrobiologiya = Microbiology. 2008;77(2):219-223. DOI 10.1134/S002626170802015X.

9. Cira-Chávez L.A., Guevara-Luna J., Soto-Padilla M.Y., RománPonce B., Vásquez-Murrieta M.S., Estrada-Alvarado M.I. Kinetics of halophilic enzymes. In: Rajendran L., Fernandez C. (Eds.). Kinetics of Enzymatic Synthesis. IntOpen, 2018;1-25. DOI 10.5772/intechopen.81100.

10. Corral P., Amoozegar M.A., Ventosa A. Halophiles and their biomolecules: recent advances and future applications in biomedicine. Marine Drugs. 2020;18:2-33. DOI 10.3390/md18010033.

11. Delgado-García M., Valdivia-Urdiales B., Aguilar-Gonzalez C.N., Contreras-Esquivel J.C., Rodriguez-Herrera R. Halophilic hydrolases as a new tool for the biotechnological industries. J. Sci. Food Agric. 2012;92(13):2575-2580. DOI 10.1002/jsfa.5860.

12. De Lourdes Moreno M., Pérez D., García M.T., Mellado E. Halophilic bacteria as a source of novel hydrolytic enzymes. Life. 2013;3(1): 38-51. DOI 10.3390/life3010038.

13. Di Donato P., Buono A., Poli A., Finore I., Abbamondi R.G., Nicolaus B., Lama L. Exploring marine environments for the identification of extremophiles and their enzymes for sustainable and green bioprocesses. Sustainability. 2019;11:149-169. DOI 10.3390/su11010149.

14. Franzmann P.D., Wehmeyer U., Stackebrandt E. Halomonadaceae fam. nov., a new family of the class Proteobacteria to accommodate the genera Halomonas and Deleya. Syst. Appl. Microbiol. 1988;11: 16-19.

15. Ghosh S., Kumar S., Kumar Khare S. Microbial diversity of saline habitats: an overview of biotechnological applications. In: Giri B., Varma A. (Eds.). Microorganisms in Saline Environments: Strategies and Functions (Ser. Soil Biology. 56). Cham: Springer, 2019;65-92. DOI 10.1007/978-3-030-18975-4_4.

16. Gordon R.E., Smith M.M. Rapidly growing, acid fast bacteria. I. Species descriptions of Mycobacterium phlei Lehmann and Neumann and Mycobacterium smegmatis (Trevisan) Lehmann and Neumann. J. Bacteriol. 1953;66(1):41-48.

17. Gridneva E.V., Grabovich M.Yu., Dubinina G.A., Chernousova E.Yu., Akimov V.N. Ecophysiology of lithotrophic sulfur-oxidizing Sphaerotilus species from sulfide springs in the Northern Caucasus. Mikrobiologiya = Microbiology. 2009;78(1):76-83.

18. Heyndrickx M., Lebbe L., Kersters K., De Vos P., Forsyth G., Logan N.A. Virgibacillus: a new genus to accommodate Bacillus pantothenticus (Proom and Knight 1950). Emended description of Virgibacillus pantothenticus. Int. J. Syst. Bacteriol. 1998;48(1):99-106. DOI 10.1099/00207713-48-1-99.

19. Heyrman J., Logan N.A., Busse H.-J., Balcaen A., Lebbe L., RodriguezDiaz M., Swings J., De Vos P. Virgibacillus carmonensis sp. nov., Virgibacillus necropolis sp. nov. and Virgibacillus picturae sp. nov., three novel species isolated from deteriorated mural paintings, transfer of the species of the genus Salibacillus to Virgibacillus, as Virgibacillus marismortui comb. nov. and Virgibacillus salexigens comb. nov., and emended description of the genus Virgibacillus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003;53(2):501-511. DOI 10.1099/ijs.0.02371-0.

20. Holt J.R., Corey D.P., Eatock R.A. Mechanoelectrical transduction and adaptation in hair cells of the mouse utricle, a low-frequency vestibular organ. J. Neurosci. 1997;17:8739-8748.

21. Hua N.P., Hamza-Chaffai A., Vreeland R.H., Isoda H., Naganuma T. Virgibacillus salarius sp. nov., a halophilic bacterium isolated from a Saharan salt lake. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008;58:2409-2414. DOI 10.1099/ijs.0.65693-0.

22. Kaitouni L.B.D., Anissi J., Sendide K., Hassouni M.E. Diversity of hydrolase-producing halophilic bacteria and evaluation of their enzymatic activities in submerged cultures. Annals Microbiol. 2020; 70:33. DOI 10.1186/s13213-020-01570-z.

23. Khalilova E.A., Kotenko S.Ts., Islammagomedova E.A., Hasanov R.Z., Abakarova A.A., Aliverdiyeva D.A. Extremophilic microbial communities of saline soils and their diversity in the regions of the Caspian depression. Aridnye Ekosistemy = Arid Ecosystems. 2017;7(2): 116-120. DOI 10.1134/S2079096117020068.

24. Khalilova E.A., Kotenko S.Ts., Islammagomedova E.A., Hasanov R.Z., Abakarova A.A., Aliverdiyeva D.A. Halophilic microbial communities and their biodiversity in the arid regions of the Caspian Lowland. Aridnye Ekosistemy = Arid Ecosystems. 2020;10(1):79-85. DOI 10.1134/S2079096120010084.

25. Khalilova E.A., Nuratinov R.A., Kotenko S.Ts., Islammagomedova E.A. Hydrocarbon-oxidizing microorganisms of hot springs and their significance in the assessment of the biodiversity of microbial communities. Aridnye Ekosistemy = Arid Ecosystems. 2014;4(1): 25-30. DOI 10.1134/S2079096114010028.

26. Kindzierski V., Raschke S., Knabe N., Siedler F., Scheffer B., Grau K.P., Pfeiffer F., Oesterhelt D., Marin-Sanguino A., Kunte H.J. Osmoregulation in the halophilic bacterium Halomonas elongata: a case study for integrative systems biology. PLoS One. 2017;12(1):1-22. DOI 10.1371/journal.pone.0168818.

27. Kolganova T.V., Kuznetsov B.B., Turova T.P. Designing and testing of oligonucleotide primers for amplification and sequencing of 16S rRNA genes of archaea. Mikrobiologiya = Microbiology. 2002; 71(2):243-246.

28. Kushner D.J., Kamekura M. Physiology of halophilic eubacteria. In: Rodríguez-Varela F. (Ed.). Halophilic Bacteria. Boca Raton, FL, USA: CRC Press, 1988;1:109-138.

29. Kuznetsov A.E., Kalenov S.V. Russian Federation Patent RU 2323226. Method for preparing halophilic bacterium biomass. Bull. No. 12. 2008;6. (in Russian)

30. Lalov V.V., Osokina N.V., Piorunskij D.A., Chizhikov M.A. Russian Federation Patent RU 2115722 C1. Method of halophilic microorganism culturing. 1998;5 (in Russian)

31. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. In: Stackebrandt E., Goodfellow M. (Eds.). New York: John Wiley & Sons, 1991;115-175.

32. Lee S.-Y., Kang C.-H., Oh T.K., Yoon J.H. Virgibacillus campisalis sp. nov., from a marine solar saltern. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012;62:347-351. DOI 10.1099/ijs.0.033084-0.

33. Liu C., Baffoe D.K., Zhang M. Halophile, an essential platform for bioproduction. J. Microbiol. Methods. 2019;166:105704. DOI 10.1016/j.mimet.2019.105704.

34. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 1961;3:208-218. DOI 10.1016/S0022-2836(61)80047-8.

35. Namsaraev Z.B., Babasanova O.B., Dunaevsky Y.E., Akimov V.N., Barkhutova D.D., Gorlenko V.M., Namsaraev B.B. Anoxybacillus mongoliensis sp. nov., a novel thermophilic proteinase producing bacterium isolated from alkaline hot spring, Central Mongolia. Microbiology. 2010;79(4):491-499.

36. Netrusov A.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. Laboratory Manual on Microbiology for college students. Moscow: Akademiya Publ., 2005. (in Russian)

37. Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. Determination of DNA base composition from melting profiles in dilute buffers. Biopolimers. 1969; 7:503-516.

38. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proс. Natl. Acad. Sci. USA. 1977;84:5463-5467.

39. Schwibbert K., Marin-Sanguino A., Bagyan I., Heidrich G., Lentzen G., Seitz H., Rampp M., Schuster S.C., Klenk H.P., Pfeiffer F., Oesterhelt D., Kunte H.J. A blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T. Environ. Microbiol. 2011;13:1973-1994. DOI 10.1111/j.1462-2920.2010.02336.

40. Steel K.J. The oxidase reaction as a taxonomic tool. J. Gen. Microbiol. 1961;25:297-306.

41. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 1993;10:512-526.

42. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 2013;30:2725-2729.

43. Thomas J.C., Khour R., Neeley C.K., Akroush A.M., Davies E.C. A fast CTAB method of human DNA isolation for polymerase chain reaction applications. Biochem. Educ. 1997;25(4):233-235. DOI 10.1016/S0307-4412(97)00122-2.

44. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci. 1994; 10:569-570. DOI 10.1093/bioinformatics/10.5.569.

45. Varrella S., Tangherlini M., Corinaldesi C. Deep hypersaline anoxic basins as untapped reservoir of polyextremophilic prokaryotes of biotechnological interest. Mar. Drugs. 2020;18(2):91. DOI 10.3390/md18020091.

46. Vreeland R.H., Litchfield C.D., Martin E.L., Elliot E. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 1980;3(2):485-495. DOI 10.1099/00207713-30-2-485.

47. Wang T., Zhang L., Bo L., Zhu Y., Tang X., Liu W. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification at high concentrations of NaCl by Halomonas nacteria. IOP Conf. Ser: Earth. Environ. Sci. 2019;237(5):052033. DOI 10.1088/1755-1315/237/5/052033.

48. Zavarzin G.A. Microbial diversity studies at the Winogradsky Institute of Microbiology. Mikrobiologiya = Microbiology. 2004;73(5):509-522. DOI 10.1023/B:MICI.0000044242.93603.00.