Preview

Вавиловский журнал генетики и селекции

Расширенный поиск

Здесь и там: двусторонняя локализация интеграций трансгена

https://doi.org/10.18699/VJ21.068

Полный текст:

Аннотация

Полногеномные скрининговые методы, основанные на случайной интеграции экзогенных генетических конструкций, – новейший класс инструментов, открывающий возможности для изучения широкого спектра геномных процессов. Данный подход уже был применен к функциональному аннотированию генов млекопитающих, скринингу приспособленности бактерий, определению сайтов связывания факторов транскрипции, идентификации регуляторных генетических элементов и исследованию хромосомного эффекта положения. Все эти эксперименты требуют точной локализации трансгенов в геноме. Существующие на сегодняшний день методы картирования, такие как Inverse-PCR, TLA, splinkerette PCR и LAM-PCR, не позволяют одновременно определять оба участка генома, фланкирующие одну интеграцию трансгена, что ограничивает применимость подходов, в том числе связанных с хромосомной инженерией. В настоящей работе мы предлагаем метод, с помощью которого можно преодолеть это ограничение. Разработанная технология основана на фрагментации геномной ДНК, не затрагивающей интеграции трансгена. Это достигается путем исключения из последовательности вектора сайтов узнавания одного или нескольких ферментов рестрикции. Затем, как и в Inverse-PCR, были закольцованы молекулы лигированием в разбавленной смеси и секвенированы. Полученные данные дают возможность с высокой точностью идентифицировать перестройки и отделить их от артефактов лигирования, и, кроме того, отследить события транслокаций между интеграциями трансгенов. Это может быть использовано в экспериментах по изучению индуцируемых хромосомных перестроек. Для доказательства применимости метода мы с его помощью картировали интеграции транспозона Sleeping Beauty в клетки человека линии Hap1. Картированные интеграции были валидированы с помощью ПЦРанализа. В статье приведен ряд рекомендаций для практического использования этого метода в экспериментах по множественной локализации интеграций трансгенных конструкций.

Об авторах

П. А. Сальников
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет
Россия

Новосибирск



А. А. Хабарова
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Новосибирск



Г. С. Кокшарова
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Новосибирск



Р. В. Мунгалов
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Новосибирск



П. С. Белокопытова
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Новосибирск



И. Е. Пристяжнюк
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Новосибирск



А. Р. Нурисламов
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Новосибирск



П Соматич
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Новосибирск



М. М. Гридина
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

Новосибирск



В. С. Фишман
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Новосибирск



Список литературы

1. Akhtar W., de Jong J., Pindyurin A.V., Pagie L., Meuleman W., de Ridder J., Berns A., Wessels L.F., van Lohuizen M., van Steensel B. Chromatin position effects assayed by thousands of reporters integrated in parallel. Cell. 2013;154(4):914-927. DOI 10.1016/j.cell.2013.07.018.

2. Cain A.K., Barquist L., Goodman A.L., Paulsen I.T., Parkhill J., van Opijnen T. A decade of advances in transposon-insertion sequencing. Nat. Rev. Genet. 2020;21(9):526-540. DOI 10.1038/s41576-020-0244-x.

3. de Vree P.J., de Wit E., Yilmaz M., van de Heijning M., Klous P., Verstegen M.J., Wan Y., Teunissen H., Krijger P.H., Geeven G., Eijk P.P., Sie D., Ylstra B., Hulsman L.O., van Dooren M.F., van Zutven L.J., van den Ouweland A., Verbeek S., van Dijk K.W., Cornelissen M., Das A.T., Berkhout B., Sikkema-Raddatz B., van den Berg E., van der Vlies P., Weening D., den Dunnen J.T., Matusiak M., Lamkanfi M., Ligtenberg M.J., ter Brugge P., Jonkers J., Foekens J.A., Martens J.W., van der Luijt R., van Amstel H.K., van Min M., Splinter E., de Laat W. Targeted sequencing by proximity ligation for comprehensive variant detection and local haplotyping. Nat. Biotechnol. 2014;32(10):1019-1025. DOI 10.1038/nbt.2959.

4. Deutschbauer A., Price M.N., Wetmore K.M., Shao W., Baumohl J.K., Xu Z., Nguyen M., Tamse R., Davis R.W., Arkin A.P. Evidence-based annotation of gene function in Shewanella oneidensis MR-1 using genome-wide fitness profiling across 121 conditions. PLoS Genet. 2011;7(11):e1002385. DOI 10.1371/journal.pgen.1002385.

5. Dymond J., Boeke J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng. Bugs. 2012;3(3):168-171. DOI 10.4161/bbug.19543.

6. Francke U., Hsieh C.L., Kelly D., Lai E., Popko B. Induced reciprocal translocation in transgenic mice near sites of transgene integration. Mamm. Genome. 1992;3(4):209-126. DOI 10.1007/BF00355721.

7. Friedrich M.J., Rad L., Bronner I.F., Strong A., Wang W., Weber J., Mayho M., Ponstingl H., Engleitner T., Grove C., Pfaus A., Saur D., Cadiñanos J., Quail M.A., Vassiliou G.S., Liu P., Bradley A., Rad R. Genome-wide transposon screening and quantitative insertion site sequencing for cancer gene discovery in mice. Nat. Protoc. 2017; 12(2):289-309. DOI 10.1038/nprot.2016.164.

8. Gabriel R., Kutschera I., Bartholomae C.C., von Kalle C., Schmidt M. Linear amplification mediated PCR-localization of genetic elements and characterization of unknown flanking DNA. J. Vis. Exp. 2014; (88):e51543. DOI 10.3791/51543.

9. Goh K.G.K., Phan M.D., Forde B.M., Chong T.M., Yin W.F., Chan K.G., Ulett G.C., Sweet M.J., Beatson S.A., Schembri M.A. Genome-wide discovery of genes required for capsule production by uropathogenic Escherichia coli. mBio. 2017;8(5):e01558-17. DOI 10.1128/mBio.01558-17.

10. Goodman A.L., Wu M., Gordon J.I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protoc. 2011;6(12):1969-1980. DOI 10.1038/nprot.2011.417.

11. Hochrein L., Mitchell L.A., Schulz K., Messerschmidt K., MuellerRoeber B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nat. Commun. 2018;9(1):1931. DOI 10.1038/s41467-017-02208-6.

12. Laboulaye M.A., Duan X., Qiao M., Whitney I.E., Sanes J.R. Mapping transgene insertion sites reveals complex interactions between mouse transgenes and neighboring endogenous genes. Front. Mol. Neurosci. 2018;11:385. DOI 10.3389/fnmol.2018.00385.

13. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with BurrowsWheeler transform. Bioinformatics. 2009;25(14):1754-1760. DOI 10.1093/bioinformatics/btp324.

14. Li S., Jia S., Hou L., Nguyen H., Sato S., Holding D., Cahoon E., Zhang C., Clemente T., Yu B. Mapping of transgenic alleles in soybean using a nanopore-based sequencing strategy. J. Exp. Bot. 2019; 70(15):3825-3833. DOI 10.1093/jxb/erz202.

15. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 2011;17:10-12. DOI 10.14806/ej.17.1.200.

16. Moudgil A., Wilkinson M.N., Chen X., He J., Cammack A.J., Vasek M.J., Lagunas T.J., Qi Z.,Lalli M.A., Guo C., Morris S.A., Dougherty J.D., Mitra R.D. Self-reporting transposons enable simultaneous readout of gene expression and transcription factor binding in single cells. Cell. 2020;182(4):992-1008.e21. DOI 10.1016/ j.cell.2020.06.037.

17. Nicholls P.K., Bellott D.W., Cho T.J., Pyntikova T., Page D.C. Locating and characterizing a transgene integration site by nanopore sequencing. G3 (Bethesda). 2019;9(5):1481-1486. DOI 10.1534/g3.119.300582.

18. Park D., Park S.H., Ban Y.W., Kim Y.S., Park K.C., Kim N.S., Kim J.K., Choi I.Y. A bioinformatics approach for identifying transgene insertion sites using whole genome sequencing data. BMC Biotechnol. 2017;17(1):67. DOI 10.1186/s12896-017-0386-x.

19. Pindyurin A.V., de Jong J., Akhtar W. TRIP through the chromatin: a high throughput exploration of enhancer regulatory landscapes. Genomics. 2015;106(3):171-177. DOI 10.1016/j.ygeno.2015.06.009.

20. Quinlan A.R., Hall I.M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 2010;26(6):841-842. DOI 10.1093/bioinformatics/btq033.

21. Robinson J.T., Thorvaldsdóttir H., Winckler W., Guttman M., Lander E.S., Getz G., Mesirov J.P. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 2011;29(1):24-26. DOI 10.1038/nbt.1754.

22. Smith A.J., De Sousa M.A., Kwabi-Addo B., Heppell-Parton A., Impey H., Rabbitts P. A site-directed chromosomal translocation induced in embryonic stem cells by Cre-loxP recombination. Nat. Genet. 1995;9(4):376-385. DOI 10.1038/ng0495-376.

23. Uemura M., Niwa Y., Kakazu N., Adachi N., Kinoshita K. Chromosomal manipulation by site-specific recombinases and fluorescent protein-based vectors. PLoS One. 2010;5(3):e9846. DOI 10.1371/journal.pone.0009846.

24. Wang H., Mayhew D., Chen X., Johnston M., Mitra R.D. “Calling cards” for DNA-binding proteins in mammalian cells. Genetics. 2012;190(3):941-949. DOI 10.1534/genetics.111.137315.

25. Wang W., Bartholomae C.C., Gabriel R., Deichmann A., Schmidt M. The LAM-PCR method to sequence LV integration sites. Methods Mol. Biol. 2016;1448:107-120. DOI 10.1007/978-1-4939-3753-0_9.

26. Zastrow-Hayes G.M., Lin H., Sigmund A.L., Hoffman J.L., Alarcon C.M., Hayes K.R., Richmond T.A., Jeddeloh J.A., May G.D., Beatty M.K. Southern-by-sequencing: A robust screening approach for molecular characterization of genetically modified crops. Plant Genome. 2015;8(1):1-15. DOI 10.3835/plantgenome2014.08.0037.

27. Zhang R., Yin Y., Zhang Y., Li K., Zhu H., Gong Q., Wang J., Hu X., Li N. Molecular characterization of transgene integration by nextgeneration sequencing in transgenic cattle. PLoS One. 2012;7(11): e50348. DOI 10.1371/journal.pone.0050348.


Просмотров: 146


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2500-0462 (Print)
ISSN 2500-3259 (Online)