Оценка компетентности к развитию ооцит-кумулюсных комплексов Sus scrofa domesticus (L.) после интра- и экстраовариальной витрификации

Цель настоящей работы – идентификация влияния экстра- (ЭОВ) и интраовариальной витрификации (ИОВ) на митохондриальную активность (МА), состояния хроматина в ооцитах свиней в процессе созревания in vitro. При ЭОВ ооциты свиней обрабатывали растворами криопротекторов (КПР): КПР-1 – 0.7 M диметилсульфоксида (ДМСО)+0.9 M этиленгликоля (ЭГ); КПР-2 – 1.4 M ДМСО+1.8 M ЭГ; КПР-3 – 2.8 M ДМСО+ 3.6 M ЭГ+0.65 M трегалозы. При ИОВ фрагменты яичников опускали в КПР-1 – 7.5 % ЭГ+7.5 % ДМСО, затем в КПР-2 – 15 % ЭГ, 15 % ДМСО и 0.5 М сахарозы. Пайеты с ооцитами и фрагменты яичников погружали и хранили в LN2. Для девитрификации ЭОВ ооциты экспонировали в 0.25, 0.19 и 0.125 М растворах трегалозы, ИОВ – в 0.5 и 0.25 М трегалозы. Ооциты культивировали в среде NCSU-23 с 10 % жидкости фолликулов, их стенками, гормонами. Все среды дополняли 0.001 % наночастиц высокодисперсного кремнезема (Институт химии поверхности им. А.А. Чуйко Национальной академии наук Украины, Украина). Режимы оплодотворения и культивирования эмбрионов представлены нами в методических рекомендациях. Митохондриальную активность и статус хроматина оценивали MitoTracker Orange CMTMRos и цитогенетическим методом. Выявлены достоверные различия в уровне ооцитов c высокоэкспандированным кумулюсом между контрольной и витрифицированными группами (81 % против 59 и 52 % соответственно, p ≤ 0.001). Доля пикнотических клеток у нативных ооцитов составила 19 %, у ЭОВ и ИОВ ооцитов – 39 и 49 % соответственно. Стадии метафазы II достигли 86 % нативных ооцитов, и только 48 % ЭОВ и 33 % ИОВ ооцитов завершили созревание (р ≤ 0.001). Отмечена достоверная разница в МА между группами, подвергнутыми ИОВ и ЭОВ (89.4±7.5 и 149.2±11.3 мкА соответственно, р < 0.05). Впервые получены доимлантационные эмбрионы из ооцитов свиней, подвергнутых интраовариальной витрификации.

1. Abeydeera L.R., Wang W.H., Cantley T.C., Prather R.S., Day B.N. Presence of beta-mercaptoethanol can increase the glutathione content of pig oocytes matured in vitro and the rate of blastocyst development after in vitro fertilization. Theriogenology. 1998;50:747-756. DOI 10.1016/s0093-691x(98)00180-0.

2. Al-Zubaidi U., Liu J., Cinar O., Robker R.L., Adhikari D., Carroll J. The spatio-temporal dynamics of mitochondrial membrane potential during oocyte maturation. Mol. Hum. Rep. 2019;25(11):695-705. DOI 10.1093/molehr/gaz055.

3. Amstislavsky S.Y., Brusentsev E.Y., Rozhkova I.N., Okotrub K.A. Embryo and gamete cryopreservation for genetic resources conservation of laboratory animals. Russ. J. Dev. Biol. 2015;46(2):47-59. DOI 10.1134/S1062360415020022.

4. Appeltant R., Somfai T., Santos E.C.S., Dang-Nguyen T.Q., Nagai T., Kikuchi K. Effects of vitrification of cumulus-enclosed porcine oocytes at the germinal vesicle stage on cumulus expansion, nuclear progression and cytoplasmic maturation. Reprod. Fertil. Dev. 2017; 29(12):2419-2429. DOI 10.1071/RD16386.

5. Bielanski A. A review of the risk of contamination of semen and embryos during cryopreservation and measures to limit cross-contamination during banking to prevent disease transmission in ET practices. Theriogenology. 2012;77(3):467-482. DOI 10.1016/j.theriogenology.2011.07.043.

6. Buderatska N.O., Petrushko M.P. Oocytes as alternative to embryos in cryopreservation applied in assisted reproductive technologies. Probl. Cryobiol. Cryomed. 2016;26(4):375-382. DOI 10.15407/cryo26.04.375.

7. Coello A., Pellicer A., Cobo A. Vitrification of human oocytes. Minerva Ginecol. 2018;70(4):415-423. DOI 10.23736/S0026-4784.18. 04218-1.

8. Galagan N.P., Klymenko N.Y., Orel I.L., Novikova E.A., Turov V.V. Biofunctional nanomaterials based on ultrafine silica, protein and aminocarbohydrates. Biopolym. Cell. 2010;26(3):205-213. DOI 10.7124/bc.000158.

9. Joaquim D.C., Borges E.D., Viana I.G.R., Navarro P.A., Vireque A.A. Risk of contamination of gametes and embryos during cryopreservation and measures to prevent cross-contamination. BioMed Res. Int. 2017;4:1-11. DOI 10.1155/2017/1840417.

10. Kline D., Kline J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev. Biol. 1992;149:80-89. DOI 10.1016/0012-1606(92)90265-i.

11. Kokotsaki M., Mairhofer M., Schneeberger C., Marschalek J., Pietrowski D. Impact of vitrification on granulosa cell survival and gene expression. Cryobiology. 2018;85:73-78. DOI 10.1016/j.cryobiol. 2018.09.006.

12. Kuzmina T.I., Alm H., Тorner H. Methods of Porcine Embryo Production in vitro. St. Petersburg, 2008. (in Russian)

13. Kuzmina T.I., Chistyakova I.V. Assessment of competence for the development of Bos taurus oocytes after intra- or extraovarial vitrification. Dostizheniya Nauki i Tekhniki APK = Achievements of Science and Technology of AIC. 2020;34(2):61-64. DOI 10.24411/ 0235- 2451-2020-10213. (in Russian)

14. Kuzmina T.I., Epishko O.A., Usenbekov E.S. Effect of vitrification on mitoсhondrial activity of oocytes during in vitro maturation. Veterinariya = Veterinary. 2019;4:38-41. DOI 10.30896/0042-4846.2019. 22.4.38-41. (in Russian)

15. Lai D., Ding J., Smith G.W., Smith G.D., Takayama S. Slow and steady cell shrinkage reduces osmotic stress in bovine and murine oocyte and zygote vitrification. Hum. Rep. 2014;30(1):37-45. DOI 10.1093/humrep/deu284.

16. Larman M.G., Sheehan C.B., Gardner D.K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 2006; 131:53-61. DOI 10.1530/rep.1.00878.

17. Mehlmann L.M. Stops and starts in mammalian oocytes: recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation. Reproduction. 2005;130(6):791-799. DOI 10.1530/rep.1.00793.

18. Moussa M., Shu J., Zhang X., Zeng F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspective. Sci. China Life Sci. 2014;57(9):903-914. DOI 10.1007/s11427-014-4689-z.

19. Mullen S.F., Fahy G.M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 2012;78: 1709-1719. DOI 10.1016/j.theriogenology.2012.06.008.

20. Novoderezhkina E.A., Zhivotovsky B.D., Gogvadze V.G. Induction of unspecific permeabilization of mitochondrial membrane and its role in cell death. Mol. Biol. 2016;50(1):43-58. DOI 10.1134/S0026893316010167.

21. Obata R., Nakumura Y., Okuyama N., Sasaki C. Comparison of residual dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) concentration in bovine ovarian tissue during warming steps between slow freezing and vitrification. Cryo Lett. 2018;39(4):251-254. PMID: 30963170.

22. Pereira B.C., Ortiz I., Dorado J.M., Diaz-Jimenez M.A., Consuegra C., Gosalvez J., Hidalgo M. Effect of permeable cryoprotectant-free vitrification on DNA fragmentation of equine oocyte-cumulus cells. Reprod. Domest. Anim. 2019;54(3):53-56. DOI 10.1111/rda.13491.

23. Shahsavari M.H., Moghaddam G., Daghigh Kia H. Effects of new synthetic cryoprotectant agents on histological characteristics of various classes of vitrified bovine pre-antral follicles. Vet. Res. Forum. 2019;10(1):9-16. DOI 10.30466/vrf.2019.34306.

24. Spricigo J., Rumpf R., Dode M.A.N. Vitrification of bovine oocytes: effect of the meiotic stage on nuclear and cytoplasmic maturation. Biol. Reprod. 2011;85(1):721. DOI 10.1093/biolreprod/85.s1.721.

25. Tarkowski A.K. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse eggs. Cytogenetic. 1966;1:394-400.

26. Wei J.H., Yuan X.Y., Zhang J.M., Wei J.Q. Caspase activity and oxidative stress of granulosa cells are associated with the viability and developmental potential of vitrified immature oocytes. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2016;198:22-26. DOI 10.1016/ j.ejogrb.2015.12.010.

27. Yang C.R., Miao D.Q., Zhang Q.H., Guo L., Tong J.S., Wei Y., Huang X., Hou Y., Schatten H., Liu Z., Sun Q.Y. Short-term preservation of porcine oocytes in ambient temperature: novel approaches. PLoS One. 2010;5(12):e14242. DOI 10.1371/journal.pone.0014242.

28. Yang C.R., Wei Y., Qi S.T., Chen L., Zhang Q.H., Ma J.Y., Luo Y.B., Wang Y.P., Hou Y., Schatten H., Liu Z.H., Sun Q.Y. The G protein coupled receptor 3 is involved in cAMP and cGMP signaling and maintenance of meiotic arrest in porcine oocytes. PLoS One. 2012; 7(6):e38807. DOI 10.1371/journal.pone.0038807.

29. Yurchuk T., Petrushko M., Fuller B. Science of cryopreservation in reproductive medicine – Embryos and oocytes as exemplars. Early Hum. Dev. 2018;126:6-9. DOI 10.1016/j.earlhumdev.2018.08.016.

30. Zavodnik I.B. Mitochondria, calcium homeostasis and calcium signaling. Biomeditsinskaya Khimiya = Biomedical Chemistry. 2016; 62(3):311-317. DOI 10.18097/PBMC20166203311. (in Russian)