Получение рекомбинантного штамма Komagataella phaffi – продуцента протеиназы К из Tritirachium album

А. Б. Беклемишев; М. Б. Пыхтина; Я. М. Куликов; Т. Н. Горячковская; Д. В. Бочков; С. В. Сергеева; А. Р. Васильева; В. П. Романов; Д. С. Новикова; С. Е. Пельтек

doi:10.18699/VJ21.102

Получение рекомбинантного штамма Komagataella phaffi – продуцента протеиназы К из Tritirachium album

А. Б. Беклемишев, М. Б. Пыхтина, Я. М. Куликов, Т. Н. Горячковская, Д. В. Бочков, С. В. Сергеева, А. Р. Васильева, В. П. Романов, Д. С. Новикова, С. Е. Пельтек

https://doi.org/10.18699/VJ21.102

Полный текст:

PDF (Eng) |

сгенерировать QR код

Аннотация

Объектами исследования являлись рекомбинантные штаммы Komagataella phafi K51, несущие интегрированный в их геном гетерологичный ген протеиназы К (PK-w) из Tritirachium album, а также препарат рекомбинантной протеиназы К, полученный из этих штаммов. Целью работы было изучение возможности получения рекомбинантных штаммов K. phafi K51, обеспечивающих высокий уровень синтеза функционально активной протеиназы К из T. album, и анализ ферментативной активности полученного рекомбинантного энзима. В работе использованы методы компьютерного анализа первичной структуры гена протеиназы К, молекулярно-биологические методы (ПЦР, электрофорез ДНК в агарозных гелях, электрофорез белков в SDS-ПААГ в денатурирующих условиях, спектрофотометрия, методы количественного определения активности протеаз), генно-инженерные методы (методы клонирования и селекции генов в бактериальных клетках Escherichia coli str. TOP10 и в метилотрофных дрожжах K. phafi str. K51). Спроектирован ген природной протеиназы К (PK-w), оптимизированный для экспрессии в дрожжах K. phafi K51. Осуществлены синтез и клонирование синтезированного гена протеиназы К в составе вектора pPICZα-A в клетках E. coli str. TOP10. Ген протеиназы К встроен в векторную плазмиду pPICZα-A таким образом, чтобы на последующем этапе переклонирования в клетках дрожжей обеспечить его эффективную экспрессию под контролем промотора и терминатора гена AOX1, а продукт экспрессии клонированного гена содержал сигнальный пептид альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae для обеспечения секреции белка в культуральную жидкость. Проведено переклонирование рекомбинантной плазмиды (pPICZα-A/PK-w) в клетках дрожжей K. phafi str. K51. Получен рекомбинантный штамм K. phafi K51, несущий синтетический ген протеиназы К и обеспечивающий его экспрессию в дрожжах и секрецию в культуральную среду. Приблизительный выход рекомбинантной протеиназы К после четырех суток культивирования дрожжевых рекомбинантных клонов составил 25 мкг/мл. Полученный препарат рекомбинантной протеазы обладает высокой удельной протеолитической активностью, составляющей ~5000 Ед/мг.

Ключевые слова

протеиназа К, клонирование гена, Komagataella phafi, экспрессия гена, активность фермента

Об авторах

А. Б. Беклемишев

Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины; Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Россия

Новосибирск, Россия

М. Б. Пыхтина

Новосибирск, Россия

Я. М. Куликов

Новосибирск, Россия

Т. Н. Горячковская

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
Россия

Новосибирск, Россия

Д. В. Бочков

Новосибирск, Россия

С. В. Сергеева

Новосибирск, Россия