Система молекулярных маркеров для идентификации аллелей генов короткостебельности Rht-B1 и Rht-D1 у мягкой пшеницы

Мутантные аллели генов Rht-B1 и Rht-D1 (Reduced height) широко используют для создания короткостебельных сортов мягкой пшеницы интенсивного типа. Эти гены и фланкирующие их области секвенированы, в последовательностях описаны ассоциированные с изменением высоты растения однонуклеотидные замены, приводящие к образованию нонсенс-кодонов (аллели Rht-B1b, Rht-B1e, Rht-B1p и Rht-D1b), и различные инсерции (аллели Rht-B1c, Rht-B1h и Rht-B1i-1). Для идентификации такого типа однонуклеотидных мутаций разработаны ДНК-маркеры, основанные на принципе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако идентификация аллелей этим методом предъявляет повышенные требования к соблюдению условий реакции, а получаемые результаты не всегда однозначны. Альтернативой может быть CAPS-технология, детектирующая различия в последовательностях путем рестрикции ПЦР-продуктов. В случае отсутствия рестриктаз, способных расщеплять ДНК в месте локализации точковой мутации, рестрикционные сайты могут быть искус- ственно внесены в последовательность праймера (derived CAPS). Цель настоящей работы – разработать CAPS-и dCAPS-маркеры для выявления замен оснований, подобрать по литературным источникам STS-маркеры для детекции инсерций и тем самым предложить систему молекулярных маркеров для идентификации аллелей генов короткостебельности, часто используемых и перспективных для селекции. Разработано три CAPS-маркера для выявления аллелей Rht-B1b, Rht-D1b, Rht-B1p и два dCAPS-маркера для Rht-B1b и Rht-B1e, предложены программы для их амплификации. По литературным источникам подобраны STS-маркеры аллелей Rht-B1c, Rht-B1h, Rht-B1i-1, содержащих инсерции. Предложенная система маркеров апробирована при генотипировании 11 образцов мягкой пшеницы из коллекции ВИР, несущих вышеуказанные мутантные аллели генов короткостебельности и аллели дикого типа Rht-B1a и Rht-D1a. Наличие нонсенс-мутаций подтверждено также при помощи аллель-специфичной ПЦР. Эта система маркеров наряду с уже существующими может быть использована для идентификации аллелей генов короткостебельности Rht-B1 и Rht-D1 у мягкой пшеницы с целью генетического скрининга образцов ex situ коллекций и/или в маркер-ориентированной селекции.

1. Antonova O.Yu., Klimenko N.S., Rybakov D.A., Fomina N.A., Zheltova V.V., Novikova L.Yu., Gavrilenko T.A. SSR analysis of modern russian potato varieties using DNA samples of nomenclatural standards. Biotekhnologiya i Selektsiya Rasteniy = Plant Biotechnology and Breeding. 2020;3(4):77-96. DOI 10.30901/2658-6266-2020-4-o2. (in Russian)

2. Bazhenov M.S., Divashuk M.G., Amagai Y., Watanabe N., Karlov G.I. Isolation of the dwarfing Rht-B1p (Rht17) gene from wheat and the development of an allele-specific PCR marker. Mol. Breed. 2015; 35(11):1-8. DOI 10.1007/s11032-015-0407-1.

3. Bazhenov M.S., Nazarova L.A., Chernook A.G., Divashuk M.G. Improved marker for the Rht-B1p dwarfing allele in wheat. In: Current Challenges in Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology: Proc. of the Fifth International Scientific Conference PlantGen2019 June 24–29, 2019. Novosibirsk, Russia. Novosibirsk: ICG SB RAS. 2019;190-192. DOI 10.18699/ICG-PlantGen2019-61.

4. Borojevic K., Borojevic Ks. The transfer and history of “reduced height genes” (Rht) in wheat from Japan to Europe. J. Hered. 2005;96(4): 455-459. DOI 10.1093/jhered/esi060.

5. Börner A., Plaschke J., Korzun V., Worland A.J. The relationships between the dwarfing genes of wheat and rye. Euphytica. 1996;89(1): 69-75. DOI 10.1007/BF00015721.

6. Divashuk M.G., Bespalova L.A., Vasilyev A.V., Fesenko I.A., Puzyrnaya O.Y., Karlov G.I. Reduced height genes and their importance in winter wheat cultivars grown in southern Russia. Euphytica. 2013; 190(1):137-144. DOI 10.1007/s10681-012-0789-7.

7. Divashuk M.G., Vasilyev A.V., Bespalova L.A., Karlov G.I. Identity of the Rht-11 and Rht-B1e reduced plant height genes. Russ. J. Genet. 2012;48(7):761-763. DOI 10.1134/S1022795412050055.

8. Ellis M.H., Rebetzke G.J., Chandler P., Bonnett D., Spielmeyer W., Richards R.A. The effect of different height reducing genes on the early growth of wheat. Funct. Plant Biol. 2004;31(6):583-589. DOI 10.1071/FP03207.

9. Ellis M.H., Spielmeyer W., Gale K., Rebetzke G., Richards R. “Perfect” markers for the Rht-B1b and Rht-D1b dwarfing genes in wheat. Theor. Appl. Genet. 2002;105(6-7):1038-1042. DOI 10.1007/s00122-002-1048-4.

10. Evans L.T. Feeding the Ten Billion: Plants and Population Growth. Cambridge: Cambridge University Press, 1998.

11. Flintham J.E., Gale M.D. The Tom Thumb dwarfing gene Rht3 in wheat. Theor. Appl. Genet. 1983;66(3-4):249-256. DOI 10.1007/BF00251155.

12. Gale M.D., Marshall G.A. The chromosomal location of Gai 1 and Rht 1, genes for gibberellin insensitivity and semi-dwarfism, in a derivative of Norin 10 wheat. Heredity. 1976;37(2):283-289. DOI 10.1038/hdy.1976.88.

13. Gale M.D., Youssefian S., Russell G.E. Dwarfing genes in wheat. In: Russel G.E. (Ed.). Progress in Plant Breeding. London: Butterworths-Heinemann, 1985;1-35.

14. Grover G., Sharma A., Gill H.S., Srivastava P., Bains N.S. Rht8 gene as an alternate dwarfing gene in elite Indian spring wheat cultivars. PLoS One. 2018;13(6):e0199330. DOI 10.1371/journal.pone.0199330.

15. Guedira M., Brown-Guedira G., Van Sanford D., Sneller C., Souza E., Marshall D. Distribution of Rht genes in modern and historic winter wheat cultivars from the Eastern and Central USA. Crop Sci. 2010; 50(5):1811-1822. DOI 10.2135/cropsci2009.10.0626.

16. Hall T. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 1999;41:95-98.

17. Hedden P. The genes of the green revolution. Trends Genet. 2003; 19(1):5-9. DOI 10.1016/S0168-9525(02)00009-4.

18. Korzun V., Röder M.S., Ganal M.W., Worland A.J., Law C.N. Genetic analysis of the dwarfing gene (Rht8) in wheat. Part I. Molecular mapping of Rht8 on the short arm of chromosome 2D of bread wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 1998;96(8):1104-1109. DOI 10.1007/s001220050845.

19. Kurkiev K.U., Tyryshkin L.G., Kolesova M.A., Kurkiev U.K. Identification of Rht2 and Rht8 genes for semidwarfness in hexaploid triticale with use of DNA markers. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2008; 12(3):372-377. (in Russian)

20. Li A., Yang W., Guo X., Liu D., Sun J., Zhang A. Isolation of a gibberellin-insensitive dwarfing gene, Rht-B1e, and development of an allele-specific PCR marker. Mol. Breed. 2012;30(3):1443-1451. DOI 10.1007/s11032-012-9730-y.

21. Li A., Yang W., Lou X., Liu D., Sun J., Guo X., Wang J., Li Y., Zhan K., Ling H.Q., Zhang A. Novel natural allelic variations at the Rht-1 loci in wheat. J. Integr. Plant Biol. 2013;55(11):1026-1037. DOI 10.1111/jipb.12103.

22. Lou X., Li X., Li A., Pu M., Shoaib M., Liu D., Sun J., Zhang A., Yang W. The 160 bp insertion in the promoter of Rht-B1i plays a vital role in increasing wheat height. Front. Plant Sci. 2016;7(307): 1-13. DOI 10.3389/fpls.2016.00307.

23. Lukyanenko P.P., Zhogin A.F. Use of induced dwarf mutants in winter wheat breeding. Selektsiya i Semenovodstvo = Breeding and Seed Industry. 1974;1:13-17. (in Russian)

24. McIntosh R.A., Dubсovsky J., Rogers W.J., Morris C., Appels R., Xia X.C. Catalogue of gene symbols for wheat: 2015–2016 supplement. 2016. Available at: https://shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/macgene/supplement2015.pdf.

25. McIntosh R.A., Dubсovsky J., Rogers W.J., Xia X.C., Raupp W.J. Catalogue of gene symbols for wheat: 2018 supplement. 2018. Available at: https://wheat.pw.usda.gov/GG3/sites/default/files/Catalogue%20of%20Gene%20Symbols%20for%20Wheat%20-%20supplement2018-2019.pdf.

26. McIntosh R.A., Yamazaki Y., Dubсovsky J., Rogers J., Morris C., Appels R., Xia X.C. Catalogue of gene symbols for wheat. 2013. Available at: https://shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/download.jsp.

27. Neff M.M., Neff J.D., Chory J., Pepper A.E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 1998;14(3):387-392. DOI 10.1046/j.1365-313X.1998.00124.x.

28. Neff M.M., Turk E., Kalishman M. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends Genet. 2002;18(12):613-615. DOI 10.1016/s0168-9525(02)02820-2.

29. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012;28(8):1166-1167. DOI 10.1093/bioinformatics/bts091.

30. Pearce S., Saville R., Vaughan S.P., Chandler P.M., Wilhelm E.P., Sparks C.A., Al-Kaff N., Korolev A., Boulton M.I., Phillips A.L., Hedden P., Nicholson P., Thomas S.G. Molecular characterization of Rht-1 dwarfing genes in hexaploid wheat. Plant Physiol. 2011; 157(4):1820-1831. DOI 10.1104/pp.111.183657.

31. Peng J., Richards D.E., Hartley N.M., Murphy G.P., Devos K.M., Flintham J.E., Beales J., Fish L.J., Worland A.J., Pelica F., Sadhakar D., Christou P., Snape J.W., Gale M.D., Harberd N.P. ‘Green revolution’ genes encode mutant gibberellin response modulators. Nature. 1999;400(6741):256-261. DOI 10.1038/22307.

32. Pestsova E., Korzun V., Börner A. Validation and utilisation of Rht dwarfing gene specific. Cereal Res. Commun. 2008;36(2):235-246. DOI 10.1556/CRC.36.2008.2.4.

33. Rabinovich S.V. The breeding value of the Krasnodarskiy karlik 1 mutant. In: Chemical Mutagenesis in the Creation of Varieties with New Properties. Moscow: Nauka Publ., 1986;88-92. (in Russian)

34. Rasheed A., Wen W., Gao F., Zhai S., Jin H., Liu J., Guo Q., Zhang Y., Dreisigacker S., Xia X., He Z. Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat. Theor. Appl. Genet. 2016;129(10):1843-1860. DOI 10.1007/s00122-016-2743-x.

35. Shavrukov Y.N. CAPS markers in plant biology. Russ. J. Genet. Appl. Res. 2016;6(3):279-287. DOI 10.1134/S2079059716030114.

36. Sukhikh I.S., Vavilova V.Y., Blinov A.G., Goncharov N.P. Diversity and phenotypical effect of the allele variants of dwarfing Rht genes in wheat. Russ. J. Genet. 2021;57(2):127-138. DOI 10.1134/S1022795421020101.

37. Thomas S.G. Novel Rht-1 dwarfing genes: tools for wheat breeding and dissecting the function of DELLA proteins. J. Exp. Bot. 2017; 68(3):354-358. DOI 10.1093/jxb/erw509.

38. Tian X., Wen W., Xie L., Fu L., Xu D., Fu C., Wang D., Chen X., Xia X., Chen Q., He Z., Cao S. Molecular mapping of reduced plant height gene Rht24 in bread wheat. Front. Plant Sci. 2017;8:1-9. DOI 10.3389/fpls.2017.01379.

39. Untergasser A., Nijveen H., Rao X., Bisseling T., Geurts R., Leunissen J.A. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Res. 2007;35(2):71-74. DOI 10.1093/nar/gkm306.

40. Wen W., Deng Q., Jia H., Wei L., Wei J., Wan H., Yang L., Cao W., Ma Z. Sequence variations of the partially dominant DELLA gene Rht-B1c in wheat and their functional impacts. J. Exp. Bot. 2013; 64(11):3299-3312. DOI 10.1093/jxb/ert183.

41. Wilhelm E.P., Mackay I.J., Saville R.J., Korolev A.V., Balfourier F., Greenland A.J., Boulton M.I., Powell W. Haplotype dictionary for the Rht-1 loci in wheat. Theor. Appl. Genet. 2013;126(7):1733-1747. DOI 10.1007/s00122-013-2088-7.

42. Wu J., Kong X., Wan J., Liu X., Zhang X., Guo X., Zhou R., Zhao G., Jing R., Fu X., Jia J. Dominant and pleiotropic effects of a GAI gene in wheat results from a lack of interaction between DELLA and GID1. Plant Physiol. 2011;157(4):2120-2130. DOI 10.1104/pp.111.185272.

43. Würschum T., Langer S.M., Longin C.F.H., Tucker M.R., Leiser W.L. A modern Green Revolution gene for reduced height in wheat. Plant J. 2017;92(5):892-903. DOI 10.1111/tpj.13726.

44. Youssefian S., Kirby E.J.M., Gale M.D. Pleiotropic effects of the GA-insensitive Rht dwarfing genes in wheat. 2. Effects on leaf, stem, ear and floret growth. Field Crops Res. 1992;28(3):191-210. DOI 10.1016/0378-4290(92)90040-G.

45. Zhang X., Yang S., Zhou Y., He Z., Xia X. Distribution of the Rht-B1b, Rht-D1b and Rht8 reduced height genes in autumn-sown Chinese wheats detected by molecular markers. Euphytica. 2006;152(1): 109-116. DOI 10.1007/s10681-006-9184-6.