Молекулярно-генетические подходы к видовой идентификации паразитических плоских червей рода Ligophorus (Monogenea), обитающих на лобане

Mugil cephalus L., 1758 (лобан) – ценная промысловая рыба и перспективный объект разведения в бассейнах Черного и Азовского морей. Изучение его паразитофауны крайне важно для рыбного промысла и марикультуры. Одними из массовых эктопаразитов, обитающих на жабрах кефалевых, являются моногенеи рода Ligophorus. На лобане в Азово-Черноморском регионе паразитируют два представителя этого рода: Ligophorus mediterraneus Sarabeev, Balbuena et Euzet, 2005 и Ligophorus cephali Rubtsova, Balbuena, Sarabeev, Blasco-Costa et Euzet, 2006. Морфологическое определение этих видов весьма трудоемко и требует высокого уровня квалификации. Для быстрого и точного различия двух названных видов паразитов нами разработан метод, основанный на ПЦР вариабельных участков рибосомного гена 28S. Данный ген широко используется для молекулярной таксономии рода Ligophorus. В настоящей работе применялись три подхода: анализ длины амплифицированных фрагментов, аллель-специфичная ПЦР с детекцией в конечной точке и аллельспецифичная ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green. Первый подход заключался в подборе праймеров для получения ПЦР-продуктов различной длины, которые были характерны для L. mediterraneus или L. cephali. Этот подход был осуществлен благодаря наличию нескольких вариабельных локусов, которые находятся на расстоянии друг от друга. ПЦР-смесь содержала три праймера: один прямой и два обратных. Прямой праймер был комплементарен консервативному участку, который не различался между видами. Обратные праймеры были видоспецифичны, при этом для каждого вида они были комплементарны различным участкам ДНК, которые расположены на удалении 100 п. н. друг от друга. В результате L. mediterraneus характеризовался более короткими ампликонами, чем L. cephali. Для второго и третьего подхода конструировалась пара праймеров по следующему принципу: прямой праймер был комплементарен обоим видам, так как подбирался к консервативному участку гена. Обратные праймеры были видоспецифичными и разрабатывались к вариабельному участку 28S. На этом участке два вида паразита различались тремя точечными мутациями. Таким образом, одна пара праймеров была комплементарна L. mediterraneus, вторая – L. cephali. Анализ длины амплифицированных фрагментов и аллель-специфичная ПЦР в реальном времени продемонстрировали 100 % совпадение результатов генотипирования при сравнении с морфологической идентификацией и секвенированием по Сэнгеру. Разработанные протоколы генотипирования могут быть использованы не только для различия обитающих на лобане двух видов Ligophorus при экологических исследованиях и в ветеринарной практике, но и для последующей разработки подобных методов для других моногеней, среди которых много патогенных видов.

1. Bakke T.A., Cable J., Harris P.D. The biology of gyrodactylid monogeneans: the “Russian-Doll Killers”. Adv. Parasitol. 2007;64:161-376. DOI 10.1016/S0065-308X(06)64003-7.

2. Blasco-Costa I., Mìguez-Lozano R., Sarabeev V., Balbuena J.A. Molecular phylogeny of species of Ligophorus (Monogenea: Dactylogyridae) and their affinities within the Dactylogyridae. Parasitol. Int. 2012;61(6):619-627. DOI 10.1016/j.parint.2012.06.004.

3. Caltran H., Silan P., Roux M. Ligophorus imitans (Monogenea) Ectoparasite de Liza ramada (Teleostei). I. Populations naturelles et variabilité morphologique. Ecologie. 1995;26(2):95-104.

4. Cribb T.H., Chisholm L.A., Bray R.A. Diversity in the Monogenea and Digenea: does lifestyle matter? Int. J. Parasitol. 2002;32(3):321-328. DOI 10.1016/S0020-7519(01)00333-2.

5. Dmitrieva E., Dimitrov G. Variability in the taxonomic characters of Black Sea gyrodactylids (Monogenea). Syst. Parasitol. 2002;51(3):199-206. DOI 10.1023/A:1014594614921.

6. Dmitrieva E.V., Gerasev P.I., Gibson D.I., Pronkina N.V., Galli P. Descriptions of eight new species of Ligophorus Euzet & Suriano, 1977 (Monogenea: Ancyrocephalidae) from Red Sea mullets. Syst. Parasitol. 2012;81(3):203-237. DOI 10.1007/s11230-011-9341-8.

7. Dmitrieva E.V., Gerasev P.I., Merella P., Pugachev O.N. Redescription of Ligophorus mediterraneus Sarabeev, Balbuena & Euzet, 2005 (Monogenea: Ancyrocephalidae) with some methodological notes. Syst. Parasitol. 2009a;73(2):95-105. DOI 10.1007/s11230-009-9177-7.

8. Dmitrieva E.V., Gerasev P.I., Merella P., Pugachev O.N. Redescriptions of Ligophorus cephali Rubtsova, Balbuena, Sarabeev, Blasco-Costa & Euzet, 2006 and L. chabaudi Euzet & Suriano, 1977 (Monogenea: Ancyrocephalidae), with notes on the functional morphology of the copulatory organ. Syst. Parasitol. 2009b;73(3):175-191. DOI 10.1007/s11230-009-9192-8.

9. Ergens R., Gelnar M. Experimental verification of the effect of temperature on the size of hard parts of opisthaptor of Gyrodactylus katharineri Malmberg, 1964 (Monogenea). Folia Parasitologica. 1985;32(4):377-380.

10. Fromm B., Burow S., Hahn C., Bachmann L. MicroRNA loci support conspecificity of Gyrodactylus salaris and Gyrodactylus thymalli (Platyhelminthes: Monogenea). Int. J. Parasitol. 2014;44(11):787-793. DOI 10.1016/j.ijpara.2014.05.010.

11. Fromm B., Worren M.M., Hahn C., Hovig E., Bachmann L. Substantial loss of conserved and gain of novel microRNA families in flatworms. Mol. Biol. Evol. 2013;30(12):2619-2628. DOI 10.1093/molbev/mst155.

12. Gusev A.V. Method for Сollecting and Processing Materials on Monogeneans Parasitizing Fish. Leningrad: Nauka Publ., 1983. (in Russian)

13. Gusev A.V., Pugachev O.N., Ergens R.R., Khotenovskiy I.A. Class Monogenea. In: Bauer O.N., Gusev A.V. (Eds.) Key to the Parasites of Freshwater Fish of the USSR Fauna. Vol. 2. Leningrad: Nauka Publ., 1985;10-387. (in Russian)

14. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41. 1999;95-98.

15. Kalafi E.Y., Tan W.B., Town C., Dhillon S.K. Automated identification of Monogeneans using digital image processing and K-nearest neighbour approaches. BMC Bioinform. 2016;17(19):511. DOI 10.1186/s12859-016-1376-z.

16. Khang T.F., Soo O.Y.M., Tan W.B., Lim L.H.S. Monogenean anchor morphometry: systematic value, phylogenetic signal, and evolution. PeerJ. 2016;4:e1668. DOI 10.7717/peerj.1668.

17. Littlewood D.T.J. Platyhelminth systematics and the emergence of new characters. Parasite. 2008;15:333-341. DOI 10.1051/parasite/2008153333.

18. Littlewood D.T.J., Curini-Galletti M., Herniou E.A. The interrelationships of Proseriata (Platyhelminthes: Seriata) tested with molecules and morphology. Mol. Phylogenet. Evol. 2000;16(3):449-466. DOI 10.1006/mpev.2000.0802.

19. Lockyer A.E., Olson P.D., Littlewood D.T.J. Utility of complete large and small subunit rRNA genes in resolving the phylogeny of the Neodermata (Platyhelminthes): implications and a review of the cercomer theory. Biol. J. Linn. Soc. 2003;78(2):155-171. DOI 10.1046/j.1095-8312.2003.00141.x.

20. Marchiori N.C., Pariselle A., Pereira J.J., Agnèse J.-F., Durand J.-D., Vanhove M.P.M. A comparative study of Ligophorus uruguayense and L. saladensis (Monogenea: Ancyrocephalidae) from Mugil liza (Teleostei: Mugilidae) in southern Brazil. Folia Parasitol. 2015;62:024. DOI 10.14411/fp.2015.024.

21. Mieszkowska A., Górniak M., Jurczak-Kurek A., Ziętara M.S. Revision of Gyrodactylus salaris phylogeny inspired by new evidence for Eemian crossing between lineages living on grayling in Baltic and White sea basins. PeerJ. 2018;6:e5167. DOI 10.7717/peerj.5167.

22. Mladineo I., Šegvić-Bubić T., Stanić R., Desdevises Y. Morphological plasticity and phylogeny in a monogenean parasite transferring between wild and reared fish populations. PLoS One. 2013;8(4):e62011. DOI 10.1371/journal.pone.0062011.

23. Olstad K., Bachmann L., Bakke T.A. Phenotypic plasticity of taxonomic and diagnostic structures in gyrodactylosis-causing flatworms (Monogenea, Platyhelminthes). Parasitology. 2009;136:1305-1315. DOI 10.1017/S0031182009990680.

24. Pakdee W., Ogawa K., Pornruseetriratn S., Thaenkham U., Yeemin T. The first record of Ligophorus Euzet & Suriano, 1977 (Monogenea: Dactylogyridae) on Crenimugil buchanani (Teleostei: Muglidae) from Thailand based on morphological and molecular analyses. J. Helminthol. 2019;93(6):752-762. DOI 10.1017/S0022149X1800072X.

25. Poisot T., Verneau O., Desdevises Y. Morphological and molecular evolution are not linked in Lamellodiscus (Plathyhelminthes, Monogenea). PLoS One. 2011;6(10):e26252. DOI 10.1371/journal.pone.0026252.

26. Pugachev O.N., Gerasev P.I., Gussev A.V., Ergens R., Khotenowsky I. Guide to Monogenoidea of freshwater fish of Palaearctic and Amur regions. Milan: Ledizione-Ledi Publ., 2009.

27. Rodríguez-González A., Miguez-Lozano R., Llopis-Belenguer C., Balbuena J.A. Phenotypic plasticity in haptoral structures of Ligophorus cephali (Monogenea: Dactylogyridae) on the flathead mullet (Mugil cephalus): a geometric morphometric approach. Int. J. Parasitol. 2015;45(5):295-303. DOI 10.1016/j.ijpara.2015.01.005.

28. Rubio-Godoy M. Fish host-monogenean parasite interactions, with special reference to Polyopisthocotylea. In: Terrazas L.I. (Ed.) Advances in the Immunobiology of Parasitic Diseases. Thiruvananthapuram: Research Signpost, 2007;91-109.

29. Soo O.Y.M., Tan W.B., Lim L.H.S. Three new species of Ligophorus Euzet & Suriano, 1977 (Monogenea: Ancyrocephalidae) from Moolgarda buchanani (Bleeker) off Johor, Malaysia based on morphological, morphometric and molecular data. Raffles Bull. Zool. 2015;63:49-65.

30. Strona G., Montano S., Seveso D., Paolo G., Fattorini S. Identification of Monogenea made easier: a new statistical procedure for an automatic selection of diagnostic linear measurements in closely related species. J. Zoolog. Syst. Evol. Res. 2014;52(2):95-99. DOI 10.1111/jzs.12050.

31. Tokarev Yu.S., Vasilieva A.A., Grushevaya I.V., Malysh Yu.M. Multilocus genotyping as a modern approach to the diagnosis of microsporidia, obligate intracellular parasites of animals. Problemy Sovremennoi Nauki i Obrazovaniya = Problems of Modern Science and Education. 2015;12:51-55. (in Russian)

32. Vanhove M.P.M., Tessens B., Schoelinck C., Jondelius U., Littlewood D.T.J., Artois T., Huyse T. Problematic barcoding in flatworms: a case-study on monogeneans and rhabdocoels (Platyhelminthes). ZooKeys. 2013;365:355-379. DOI 10.3897/zookeys.365.5776.

33. Vignon M. Putting in shape – towards a unified approach for the taxonomic description of monogenean haptoral hard parts. Syst. Parasitol. 2011;79(3):161-174. DOI 10.1007/s11230-011-9303-1.

34. Yamaguti S. Systema helminthum. Vol. IV. Monogenea and Aspidocotylea. New York; London: Intersci. Publ., 1963.