Молекулярно-генетическое выявление и дифференциация возбудителей бактериальной полосатости листьев риса Xanthomonas oryzae pv. oryzicola

Бактерии рода Xanthomonas Dowson, 1939 поражают около 400 видов растений, в том числе важные сельскохозяйственные культуры. Бактериальная полосатость риса – одно из самых разрушительных заболеваний, вызвано бактериями вида Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang et al., 1957) Swings et al., 1990. Сильное сходство симптомов поражения с другим карантинным близкородственным патовариантом – Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama, 1922) Swings et al., 1990, а также возможность совместного заражения делают визуальную идентификацию невозможной. Карантинный статус и высокая вредоносность патогена требуют высокоэффективного, быстрого и точного метода его диагностики. Целью исследования были разработка и апробация наборов реагентов для выявления бактерии Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, вызывающей бактериальную полосатость листьев риса, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР- РВ), а также ПЦР с последующим секвенированием ампликонов. В работе изучены образцы ДНК X. o. pv. oryzae и X. o. pv. oryzicola, полученные из коллекции CIRM-CFBR (Франция). Для проверки аналитической чувствительности была создана конструкция на основе вектора pAL2-T с целевой вставкой 290 п. н. Были подобраны и апробированы праймеры и зонд для специфической амплификации фрагмента гена hpa1 методом ПЦР-РВ, позволяющие обнаруживать ДНК X. o. pv. oryzicola. Показана способность с помощью разработанных прамеров обнаруживать все штаммы X. o. pv. oryzicola, последовательности которых находились в базе данных GenBank NCBI на 11.11.2021. Аналитическая специфичность набора реагентов протестирована на выборке из ДНК, выделенных из 53 близкородственных и сопутствующих организмов, и составила на исследованной выборке 100 %. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов не обнаружено. Проверка аналитической чувствительности показала, что стабильный специфичный сигнал ПЦР-РВ наблюдался при разведении контрольной плазмиды до 25 копий на реакцию. Работоспособность полученного набора реагентов была подтверждена тестированием на пяти приборах для ПЦР-РВ разных производителей, что дает возможность рекомендовать его для проведения диагностических и скрининговых исследований. Праймеры для секвенирования seqX.o.all были подобраны на последовательность кластера генов hrp, а именно на нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Hpa1. Секвенирование выбранного участка позволяет эффективно дифференцировать бактерии вида X. oryzae.

1. Alyapkina Yu.S., Moiseeva M.V., Ksenofontova O.V., Alekseev Ya.I. Development andvalidation of multiplex real-time PCR test system for analyzing regulator elements (SsuAra promoter and E9 terminator) to detect genetically-modified strains of rape, soybeans, potatoes, and other plants. Izvestiya Timiryazevskoy Selskokhozyajstvennoy Akademii = Izvestiya of Timiryazev Agricultural Academy. 2018;3:5-16. DOI 10.26897/0021-342X-2018-3-5-16. (in Russian)

2. An S.Q., Potnis N., Dow M., Vorhölter F.J., He Y.Q., Becker A., Teper D., Li Y., Wang N., Bleris L., Tang J.L. Mechanistic insights into host adaptation, virulence and epidemiology of the phytopathogen Xanthomonas. FEMS Microbiol. Rev. 2020;44(1): 1-32. DOI 10.1093/femsre/fuz024.

3. Benedict A.A., Alvarez A.M., Berestecky J., Imanaka W., Mizumoto C.Y., Pollard L.W., Mew T.W., Gonzalez C.F. Pathovarspecific monoclonal antibodies for Xanthomonas campestris pv. oryzae and for Xanthomonas campestris pv. oryzicola. Phytopathology. 1989; 79(3):322-328. DOI 10.1094/Phyto-79-322.

4. Bogdanove A.J., Koebnik R., Lu H., Furutani A., Angiuoli S.V., Patil P.B., … Brendel V.P., Rabinowicz P.D., Leach J.E., White F.F., Salzberg S.L. Two new complete genome sequences offer insight into host and tissue specificity of plant pathogenic Xanthomonas spp. J. Bacteriol. 2011;193(19):5450-5464. DOI 10.1128/JB.05262-11.

5. Cho H.J., Park Y.J., Noh T.H., Kim Y.T., Kim J.G., Song E.S., Lee D.H., Lee B.M. Molecular analysis of the hrp gene cluster in Xanthomonas oryzae pathovar oryzae KACC10859. Microb. Pathog. 2008;44(6):473-483. DOI 10.1016/j.micpath.2007.12.002.

6. Egorova M.S., Ignatov A.N., Mazurin E.S. Improvement of PCRbased methods for detecting bacterial blight of rice. Vestnik RosFig sijskogo Universiteta Druzhby Narodov. Seriya Agronomiya i Zhivotnovodstvo = RUDN Journal of Agronomy and Animal Industries. 2014;2:22-27. DOI 10.22363/2312-797X-2014-2-22-27. (in Russian)

7. EPPO. Xanthomonas oryzae. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2007; 37(3):543-553. DOI 10.1111/j.1365-2338.2007.01162.x.

8. EPPO. Corrigendum. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2018;48(2): 318. DOI 10.1111/epp.12474.

9. Fan S., Tian F., Li J., Hutchins W., Chen H., Yang F., Yuan X., Cui Z., Yang C.H., He C. Identification of phenolic compounds that suppress the virulence of Xanthomonas oryzae on rice via the type III secretion system. Mol. Plant. Pathol. 2017;18(4): 555-568. DOI 10.1111/mpp.12415.

10. Fang Y., Wang H., Liu X., Xin D., Rao Y., Zhu B. Transcriptome analysis of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola exposed to H2O2 reveals horizontal gene transfer contributes to its oxidative stress response. PLoS One. 2019;14(10):e0218844. DOI 10.1371/journal.pone.0218844.

11. Furutani A., Tsuge S., Oku T., Tsuno K., Inoue Y., Ochiai H., Kaku H., Kubo Y. Hpa1 secretion via type III secretion system in Xanthomonas oryzae pv. oryzae. J. Gen. Plant. Pathol. 2003; 69(4):271-275. DOI 10.1007/s10327-003-0042-2.

12. Gonzalez C., Szurek B., Manceau C., Mathieu T., Séré Y., Verdier V. Molecular and pathotypic characterization of new Xanthomonas oryzae strains from West Africa. Mol. Plant Microbe Interact. 2007;20(5):534-546. DOI 10.1094/MPMI-20-5-0534.

13. Jacques M.A., Arlat M., Boulanger A., Boureau T., Carrère S., Cesbron S., Chen N.W., Cociancich S., Darrasse A., Denancé N., Fischer-Le Saux M., Gagnevin L., Koebnik R., Lauber E., Noël L.D., Pieretti I., Portier P., Pruvost O., Rieux A., Robène I., Royer M., Szurek B., Verdier V., Vernière C. Using ecology, physiology, and genomics to understand host specificity in Xanthomonas. Annu. Rev. Phytopathol. 2016;54:163-187. DOI 10.1146/annurev-phyto-080615-100147.

14. Jiang N., Yan J., Liang Y., Shi Y., He Z., Wu Y., Zeng Q., Liu X., Peng J. Resistance genes and their interactions with bacterial blight/leaf streak pathogens (Xanthomonas oryzae) in rice (Oryza sativa L.) – an updated review. Rice. 2020;13(1):3. DOI 10.1186/s12284-019-0358-y.

15. Lang J.M., Hamilton J.P., Diaz M.G.Q., Van Sluys M.A., Burgos M.R.G., Vera Cruz C.M., Buell C.R., Tisserat N.A., Leach J.E. Genomics-based diagnostic marker development for Xanthomonas oryzae pv. oryzae and X. oryzae pv. oryzicola. Plant Dis. 2010;94(3):311-319. DOI 10.1094/pdis-94-3-0311.

16. Lang J.M., Langlois P., Nguyen M.H., Triplett L.R., Purdie L., Holton T.A., Djikeng A., Vera Cruz C.M., Verdier V., Leach J.E. Sensitive detection of Xanthomonas oryzae pathovars oryzae and oryzicola by loop-mediated isothermal amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2014;80(15):4519-4530. DOI 10.1128/AEM.00274-14.

17. Leyns F., De Cleene M., Swings J.G., De Ley J. The host range of the genus Xanthomonas. Bot. Rev. 1984;50(3):308-356. DOI 10.1007/bf02862635.

18. Li Y.R., Zou H.S., Che Y.Z., Cui Y.P., Guo W., Zou L.F., Chatterjee S., Biddle E.M., Yang C.H., Chen G.Y. A novel regulatory role of HrpD6 in regulating hrp-hrc-hpa genes in Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. Mol. Plant Microbe Interact. 2011;24(9): 1086-1101. DOI 10.1094/MPMI-09-10-0205.

19. Liu W., Liu J., Triplett L., Leach J.E., Wang G.L. Novel insights into rice innate immunity against bacterial and fungal pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 2014;52:213-241. DOI 10.1146/annurev-phyto-102313-045926.

20. Mew T.W., Alvarez A.M., Leach J.E., Swings J. Focus on bacterial blight of rice. Plant Dis. 1993;77:5-12. DOI 10.1094/PD-77-0005.

21. Nino-Liu D.O., Ronald P.C., Bogdanove A.J. Xanthomonas oryzae pathovars: model pathogens of a model crop. Mol. Plant Pathol. 2006;7(5):303-324. DOI 10.1111/j.1364-3703.2006.00344.x.

22. Ou S.H. Rice Diseases. Kew: Commonwealth Mycological Institute, 1985;96-101.

23. Poulin L., Grygiel P., Magne M., Gagnevin L., Rodriguez-R L.M., Forero Serna N., Zhao S., El Rafii M., Dao S., Tekete C., Wonni I., Koita O., Pruvost O., Verdier V., Vernière C., Koebnik R. New multilocus variable-number tandem-repeat analysis tool for surveillance and local epidemiology of bacterial leaf blight and bacterial leaf streak of rice caused by Xanthomonas oryzae. Appl. Environ. Microbiol. 2014;81(2):688-698. DOI 10.1128/aem.02768-14.

24. Ryan R.P., Vorhölter F.J., Potnis N., Jones J.B., Van Sluys M.A., Bogdanove A.J., Dow J.M. Pathogenomics of Xanthomonas: understanding bacterium-plant interactions. Nat. Rev. Microbiol. 2011;9(5):344-355. DOI 10.1038/nrmicro2558.

25. Saddler G.S., Bradbury J.F. Xanthomonadales ord. nov. In: Brenner D.J., Krieg N.R., Staley J.T. (Eds.). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Boston: Springer, 2005;63-122. DOI 10.1007/0-387-28022-7_3.

26. Sakthivel N., Mortensen C.N., Mathur S.B. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in artificially inoculated and naturally infected rice seeds and plants by molecular techniques. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001;56(3-4):435-441. DOI 10.1007/s002530100641.

27. Soto-Suárez M., Gonzalez C., Piégu B., Tohme J., Verdier V. Genomic comparison between Xanthomonas oryzae pv. oryzae and Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, using suppression-subtractive hybridization. FEMS Microbiol. Lett. 2010;308(1):16-23. DOI 10.1111/j.1574-6968.2010.01985.x.

28. Swings J., Van Den Mooter M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W., Kersters K. Reclassification of the causal agents of bacterial blight (Xanthomonas campestris pv. oryzae) and bacterial leaf streak (Xanthomonas campestris pv. oryzicola) of rice as pathovars of Xanthomonas oryzae (ex Ishiyama 1922) sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 1990;40(3):309-311. DOI 10.1099/00207713-40-3-309.

29. Tang D., Wu W., Li W., Lu H., Worland A.J. Mapping of QTLs conferring resistance to bacterial leaf streak in rice. Theor. Appl. Genet. 2000;101:286-291. DOI 10.1007/s001220051481.

30. Triplett L.R., Hamilton J.P., Buell C.R., Tisserat N.A., Verdier V., Zink F., Leach J.E. Genomic analysis of Xanthomonas oryzae isolates from rice grown in the United States reveals substantial divergence from known X. oryzae pathovars. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77(12):3930-3937. DOI 10.1128/AEM.00028-11.

31. Vera Cruz C.M., Gossele F., Kersters K., Segers P., Van Den Mooter M., Swings J., De Ley J. Differentiation between Xanthomonas campetris pv. oryzae, Xanthomonas campestris pv. oryzicola and the bacterial ‘brown blotch’ pathogen on rice by numerical analysis of phenotypic features and protein gel electrophoregrams. J. Gen. Microbiol. 1984;130(11):2983-2999. DOI 10.1099/00221287-130-11-2983.

32. Wilkins K.E., Booher N.J., Wang L., Bogdanove A.J. TAL effectors and activation of predicted host targets distinguish Asian from African strains of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzicola while strict conservation suggests universal importance of five TAL effectors. Front. Plant Sci. 2015;6:536. DOI 10.3389/fpls.2015.00536.

33. Xie X., Chen Z., Cao J., Guan H., Lin D., Li C., Lan T., Duan Y., Mao D., Wu W. Toward the positional cloning of qBlsr5a, a QTL underlying resistance to bacterial leaf streak, using overlapping sub-CSSLs in rice. PLoS One. 2014;9(4):e95751. DOI 10.1371/journal.pone.0095751.

34. Zhao W.J., Zhu S.F., Liao X.L., Chen H.Y., Tan T.W. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in seeds using a specific TaqMan probe. Mol. Biotechnol. 2007;35(2):119-127. DOI 10.1007/BF02686106.

35. Zhu W., MaGbanua M.M., White F.F. Identification of two novel hrp-associated genes in the hrp gene cluster of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. J. Bacteriol. 2000;182(7):1844-1853. DOI 10.1128/JB.182.7.1844-1853.2000.

36. Zou L.F., Wang X.P., Xiang Y., Zhang B., Li Y.R., Xiao Y.L., Wang J.S., Walmsley A.R., Chen G.Y. Elucidation of the hrp clusters of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola that control the hypersensitive response in nonhost tobacco and pathogenicity in susceptible host rice. Appl. Environ. Microbiol. 2006;72(9): 6212-6224. DOI 10.1128/AEM.00511-06.