Активность гена алканмонооксигеназы alkB у штаммов углеводородокисляющих бактерий, выделенных из нефтепродуктов

Ферменты алканмонооксигеназы AlkB и Cyp153 ответственны за аэробную деградацию н-алканов нефти и нефтепродуктов. Для доказательства использования штаммами углеводородокисляющих бактерий, выделенных из авиационного керосина ТС-1 и автомобильного бензина АИ-95, н-алканов нефти и нефтепродуктов, проведена детекция ключевых генов alkB, Alk1, Alk2, Alk3 и Cyp153, кодирующих алканмонооксигеназы AlkB и Cyp153, ответственных за окисление углеводородов с определенной длиной цепи. Установлено, что штаммы бактерий, изолированные из реактивного топлива ТС-1, за исключением Deinococcus sp. Bi7, имели как минимум один из исследованных генов деградации н-алканов. Штаммы Sphingobacterium multivorum Bi2, Alcaligenes faecalis Bi3, Rhodococcus sp. Bi4, Sphingobacterium sp. Bi5, Rhodococcus erythropolis Bi6 содержали ген alkB. У штаммов углеводородокисляющих бактерий, выделенных из бензина АИ-95, этот ген алканмонооксигеназы не был детектирован. С помощью метода ПЦР в реальном времени проанализирована активность гена alkB у всех полученных из нефтепродуктов штаммов бактерий и определено число его копий. Методом ПЦР в реальном времени с использованием праймера с другой последовательностью нуклеотидов для детекции гена alkB установлена его активность у всех штаммов бактерий, выделенных из бензина АИ-95, причем штамм Paenibacillus agaridevorans Bi11 отнесен к группе с высоким уровнем его активности (1290 копий/мл). По оценке роста исследованных углеводородокисляющих бактерий на плотной минеральной среде Эванса с модельной смесью углеводородов штаммы были разделены на три группы. Отмечены совпадения результатов по распределению штаммов углеводородокисляющих бактерий в группах по активности гена alkB и группах, сформированных на основе способности роста и использования модельной смеси углеводородов и нефтепродуктов. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости применения комплекса молекулярногенетических и физиологических методов для всестороннего анализа распространения исследуемых генов у бактерий и оценки их активности в штаммах углеводородокисляющих бактерий, способных к биодеградации углеводородов нефтепродуктов.

1. Andreoni V., Bernasconi S., Colombo M., van Beilen J.B., Cavalca L. Detection of genes for alkane and naphthalene catabolism in Rhodococcus sp. strain 1BN. Environ. Microbiol. 2000;2:572-577. DOI 10.1046/j.1462-2920.2000.00134.x.

2. Cappelletti M., Fedi S., Frascari D., Ohtake H., Turner R.J., Zannoni D. Analyses of both the alkB gene transcriptional start site and alkB promoter-inducing properties of Rhodococcus sp. strain BCP1 grown on n-alkanes. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77(5):1619-1627. DOI 10.1128/AEM.01987-10.

3. Coon M.J. Cytochrome P450: nature’s most versatile biological catalyst. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005;45:1-25.

4. Dedov A.G., Ivanova E.A., Sandzhieva D.A., Kashcheeva P.B., Buznik V.M., Lobakova E.S., Kirpichnikov M.P., Ishkov A.G. New materials and ecology: biocomposites for aquatic remediation. Theor. Found. Chem. Eng. 2017;51(4):617-630. DOI 0.1134/S0040579517040042.

5. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous cultivation of micro-organisms: 2. Construction of a chemostat. In: Methods in Microbiology. Vol. 2. London; New York: Academic Press, 1970: 277-327. DOI 10.1016/S0580-9517(08)70227-7.

6. Funhoff E.G., Bauer U., García-Rubio I., Witholt B., van Beilen J.B. CYP153A6, a soluble P450 oxygenase catalyzing terminal-alkane hydroxylation. J. Bacteriol. 2006;188(14):5220-5227. DOI 10.1128/JB.00286-06.

7. Heiss-Blanquet S., Benoit Y., Marechaux C., Monot F. Assessing the role of alkane hydroxylase genotypes in environmental samples by competitive PCR. J. Appl. Microbiol. 2005;99(6):1392-1403. DOI 10.1111/j.1365-2672.2005.02715.x.

8. Ivanova A.E., Kravchenko I.K., Sukhacheva M.V., Kanat’eva A.Y.,

9. Kurganov A.A. Hydrocarbon-oxidizing potential and genes for n- alkane biodegradation in a new acidophilic mycobacterial association from sulfur blocks. Microbiology. 2014;83(6):764-772.

10. Johnson E.L., Hyman M.R. Propane and n-butane oxidation by Pseudomonas putida GPo1. Appl. Environ. Microbiol. 2006;72(1):950-952. DOI 10.1128/AEM.72.1.950-952.2006.

11. Karimova S.A. Corrosion is the main enemy of aviation. Nauka i Zhizn’ = Science and Life. 2007;6:63-65. (in Russian)

12. Kato T., Miyanaga A., Kanaya S., Morikawa M. Alkane inducible proteins in Geobacillus thermoleovorans B23. BMC Microbiol. 2009; 9(1):1-9. DOI 10.1186/1471-2180-9-60.

13. Kloos K., Munch J.C., Schloter M. A new method for the detection of alkane-monooxygenase homologous genes (alkB) in soils based on PCR-hybridization. J. Microbiol. Methods. 2006;66(3):486-496. DOI 10.1016/j.mimet.2006.01.014.

14. Kohno T., Sugimoto Y., Sei K., Mori K. Design of PCR primers and gene probes for general detection of alkane-degrading bacteria. Microbes Environ. 2002;17:114-121. DOI 10.1264/jsme2.17.114.

15. Korshunova A.V., Tourova T.P., Shestakova N.M., Mikhailova E.M., Nazina T.N., Poltaraus A.B. Detection and transcription of n-alkane biodegradation genes (alkB) in the genome of a hydrocarbonoxidizing bacterium Geobacillus subterraneus K. Microbiology. 2011;80(5):682-691.

16. Likhoshvay A., Lomakina A., Grachev M. The complete alk sequences of Rhodococcus erythropolis from Lake Baikal. Springerplus. 2014; 3(1):1-5. DOI 10.1186/2193-1801-3-621.

17. Liu C., Shao Z. Alcanivorax dieselolei sp. nov., a novel alkane-degrading bacterium isolated from sea water and deep-sea sediment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005;55(3):1181-1186. DOI 10.1099/ijs.0.63443-0.

18. Lomakina A.V., Pogodaeva T.V., Morozov I.V., Zemskaya T.I. Microbial communities of the discharge zone of oil- and gas-bearing fluids in low-mineral Lake Baikal. Microbiology. 2014;83(3):278-287. DOI 10.1134/S0026261714030126.

19. Lysak L.V., Dobrovol’skaya T.G., Skvortsova I.N. Methods for Assessing the Bacterial Diversity of Soils and the Identification of Soil Bacteria. Moscow: MAX Press Publ., 2003. (in Russian)

20. Manucharova N.A., Pozdnyakov L.A., Vlasova A.P., Yanovich A.S., Ksenofontova N.A., Kovalenko M.A., Stepanov A.L. Metabolically active prokaryotic complex in grassland and forests’ sod-podzol under polycyclic aromatic hydrocarbon influence. Forests. 2021; 12(8):1103. DOI 10.3390/f12081103.

21. Martin-Sanchez P.M., Becker R., Gorbushina A.A., Toepel J. An improved test for the evaluation of hydrocarbon degradation capacities of diesel-contaminating microorganisms. Int. Biodeterior. Biodegr. 2018;129:89-94. DOI 10.1016/j.ibiod.2018.01.009.

22. Mohanty G., Mukherji S. Biodegradation rate of diesel range n-alkanes by bacterial cultures Exiguobacterium aurantiacum and Burkholderia cepacia. Int. Biodeterior. Biodegr. 2008;61(3):240-250. DOI 10.1016/j.ibiod.2007.06.011.

23. Paisse S., Duran R., Coulon F., Goñi-Urriza M. Are alkane hydroxylase genes (alkB) relevant to assess petroleum bioremediation processes in chronically polluted coastal sediments? Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011;92(4):835-844. DOI 10.1016/j.ibiod.2007.06.011.

24. Powell S.M., Ferguson S.H., Bowman J.P., Snape I. Using real-time PCR to assess changes in the hydrocarbon-degrading microbial community in Antarctic soil during bioremediation. Microb. Ecol. 2006;52(3):523-532. DOI 10.1007/s00248-006-9131-z.

25. Redmond M.C., Valentine D.L., Sessions A.L. Identification of novel methane-, ethane-, and propane-oxidizing bacteria at marine hydrocarbon seeps by stable isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 2010;76(19):6412-6422. DOI 10.1128/AEM.00271-10.

26. Sameshima Y., Honda K., Kato J., Omasa T., Ohtake H. Expression of Rhodococcus opacus alkB genes in anhydrous organic solvents. J. Biosci. Bioeng. 2008;106(2):199-203. DOI 10.1263/jbb.106.199.

27. Shapiro T.N., Lobakova E.S., Dolnikova G.A., Ivanova E.A., Sandzhieva D.A., Burova A.A., Dedov A.G. Community of hydrocarbonoxidizing bacteria in petroleum products on the example of TS-1 jet fuel and AI-95 gasoline. Appl. Biochem. Microbiol. 2021;57(9): 949-961. DOI 10.1134/S0003683821090076.

28. Sierra-García I.N., Alvarez J.C., de Vasconcellos S.P., de Souza A.P., dos Santos Neto E.V., de Oliveira V.M. New hydrocarbon degradation pathways in the microbial metagenome from Brazilian petroleum reservoirs. Plos One. 2014;9(2):E90087. DOI 10.1371/journal.pone.0090087.

29. Smith C.B., Tolar B.B., Hollibaugh J.T., King G.M. Alkane hydroxylase gene (alkB) phylotype composition and diversity in northern Gulf of Mexico bacterioplankton. Front. Microbiol. 2013;4:370. DOI 10.3389/fmicb.2013.00370.

30. Smits T.H.M., Röthlisberger M., Witholt B., Van Beilen J.B. Molecular screening for alkane hydroxylase genes in Gram-negative and Gram-positive strains. Appl. Environ. Microbiol. 1999;1(4):307-317. DOI 10.1046/j.1462-2920.1999.00037.x.

31. Throne-Holst M., Wentzel A., Ellingsen T.E., Kotlar H.K., Zotchev S.B. Identification of novel genes involved in long-chain n-alkane degradation by Acinetobacter sp. strain DSM 17874. Appl. Environ. Microbiol. 2007;73(10):3327-3332. DOI 10.1128/AEM.00064-07.

32. Timergazina I.F., Perekhodova L.S. Biological oxidation of oil and petroleum products using hydrocarbon-oxidizing microorganisms. Neftegazovaya Geologiya. Teoriya i Praktika = Petroleum Geology. Theoretical and Applied Studies. 2012;7(1):15. (in Russian)

33. Turova T.P., Nazina T.N., Mikhailova E.M., Rodionova T.A., Ekimov A.N., Mashukova A.V., Poltaraus A.B. AlkB homologues in thermophilic bacteria of the genus Geobacillus. Mol. Biol. (Mosk.). 2008;42(2):247-257.

34. Van Beilen J.B., Funhoff E.G. Alkane hydroxylases involved in microbial alkane degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007;74(1): 13-21. DOI 10.1007/s00253-006-0748-0.

35. Van Beilen J.B., Funhoff E.G., van Loon A., Just A., Kaysser L., Bouza M., Witholt B. Cytochrome P450 alkane hydroxylases of the CYP153 family are common in alkane-degrading eubacteria lacking integral membrane alkane hydroxylases. Appl. Environ. Microbiol. 2006;72(1):59-65. DOI 10.1128/AEM.72.1.59-65.2006.

36. Van Beilen J.B., Li Z., Duetz W.A., Smits T.H., Witholt B. Diversity of alkane hydroxylase systems in the environment. Oil Gas Sci. Technol. 2003;58(4):427-440. DOI 10.2516/ogst:2003026.

37. Van Beilen J.B., Smits T.H., Whyte L.G., Schorcht S., Röthlisberger M., Plaggemeier T., Witholt B. Alkane hydroxylase homologues in Gram-positive strains. Environ. Microbiol. 2002;4(11):676-682. DOI 10.1046/j.1462-2920.2002.00355.x.

38. Vomberg A., Klinner U. Distribution of alkb genes within n-alkanedegrading bacteria. J. Appl. Microbiol. 2000;89(2):339-348. DOI 10.1046/j.1365-2672.2000.01121.x.

39. Wang L., Wang W., Lai Q., Shao Z. Gene diversity of CYP153A and AlkB alkane hydroxylases in oil-degrading bacteria isolated from the Atlantic Ocean. Environ. Microbiol. 2010;12(5):1230-1242. DOI 10.1111/j.1462-2920.2010.02165.x.

40. Wasmund K., Burns K.A., Kurtböke D.I., Bourne D.G. Novel alkane hydroxylase gene (alkB) diversity in sediments associated with hydrocarbon seeps in the Timor Sea, Australia. Appl. Environ. Microbiol. 2009;75(23):7391-7398. DOI 10.1128/AEM.01370-09.

41. Whyte L.G., Hawari J., Zhou E., Bourbonnière L., Inniss W.E., Greer C.W. Biodegradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. Appl. Environ. Microbiol. 1998;64(7):2578-2584. DOI 10.1128/AEM.64.7.2578-2584.1998.

42. Whyte L.G., Smits T.H.M., Labbé D., Witholt B., Greer C.W., van Beilen J.B. Prevalence of alkane monooxygenase genes in Arctic and Antarctic hydrocarbon-contaminated and pristine soils. FEMS Microb. Ecol. 2002;41(2):141-150. DOI 10.1111/j.1574-6941.2002.tb00975.x.

43. Zhurina M.V., Strelkova E.A., Plakunov V.K., Belyaev S.S. Effect of reconstituted biofilm composition on bacterial hydrocarbonoxidizing activity. Microbiology. 2008;77(5):625-627.