Влияние предварительной обработки образцов периферической крови человека на качество Hi-C библиотек

Метод захвата конформации хроматина в его полногеномном варианте (Hi-C) – мощный инструмент не только для выявления закономерностей пространственной организации генома, но и для понимания влияния их нарушения на развитие заболеваний. Кроме того, метод может быть использован для детекции хромосомных перестроек, в том числе сбалансированных транслокаций и инверсий. Применение метода Hi-C для поиска хромосомных перестроек получает все более широкое распространение. Это связано с тем, что современные высокопроизводительные методы анализа генома позволяют эффективно детектировать точечные мутации и несбалансированные хромосомные перестройки. Однако чувствительность этих методов для определения сбалансированных транслокаций и инверсий остается достаточно низкой. Хранение образцов цельной крови может влиять на количество и целостность выделяемой из них геномной ДНК, а кроме того, приводить к искажению результатов последующих анализов в том случае, если хранение осуществлялось в ненадлежащих условиях. Метод Hi-C крайне требователен к исходному материалу, так как необходимым условием для его успешного применения и получения качественных данных является сохранение пространственной укладки хроматина внутри ядра. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы определить оптимальные условия хранения крови для проведения последующего анализа Hi-C. Были выбраны 10 различных условий хранения образцов крови и пробоподготовки. Для каждого условия приготовлены Hi-C библиотеки и отсеквенированы, после чего оценивалось качество полученных библиотек. В результате сформулированы требования к хранению и подготовке образцов, необходимые для получения качественных Hi-C данных. Нами установлен минимальный объем образца крови, достаточный для проведения Hi-C анализа. Помимо этого, мы определили способы выделения ядерных элементов крови и их долгосрочного хранения, наиболее подходящие для последующего проведения Hi-C анализа. Основное требование, сформулированное нами, – не замораживать цельную кровь.

1. Al-Salmani K., Abbas H.H., Schulpen S., Karbaschi M., Abdalla I., Bowman K.J., So K.K., Evans M.D., Jones G.D., Godschalk R.W., Cooke M.S. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radic. Biol. Med. 2011;51(3):719-725. DOI 10.1016/j.freeradbiomed.2011.05.020.

2. Belaghzal H., Dekker J., Gibcus J.H. Hi-C 2.0: an optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 2017;123:56-65. DOI 10.1016/j.ymeth.2017.04.004.

3. Brown W.E., Hu J.C., Athanasiou K.A. Ammonium-chloride-potassium lysing buffer treatment of fully differentiated cells increases cell purity and resulting neotissue functional properties. Tissue Eng. Part C Methods. 2016;22(9):895-903. DOI 10.1089/ten.tec.2016.0184.

4. Caboux E., Lallemand C., Ferro G., Hémon B., Mendy M., Biessy C., Sims M., Wareham N., Britten A., Boland A., Hutchinson A., Siddiq A., Vineis P., Riboli E., Romieu I., Rinaldi S., Gunter M.J., Peeters P.H.M., van der Schouw Y.T., Travis R., Bueno-de-Mesquita H.B., Canzian F., Sánchez M.-J., Skeie G., Olsen K.S., Lund E., Bilbao R., Sala N., Barricarte A., Palli D., Navarro C., Panico S., Redondo M.L., Polidoro S., Dossus L., Boutron-Ruault M.C., Clavel-Chapelon F., Trichopoulou A., Trichopoulos D., Lagiou P., Boeing H., Fisher E., Tumino R., Agnoli C., Hainaut P. Sources of pre-analytical variations in yield of DNA extracted from blood samples: analysis of 50,000 DNA samples in EPIC. PLoS One. 2012;7(7):e39821. DOI 10.1371/journal.pone.0039821.

5. Chakraborty A., Ay F. Identification of copy number variations and translocations in cancer cells from Hi-C data. Bioinformatics. 2018; 34(2):338-345. DOI 10.1093/bioinformatics/btx664.

6. Díaz N., Kruse K., Erdmann T., Staiger A.M., Ott G., Lenz G., Vaquerizas J.M. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nat. Commun. 2018;9(1):4938. DOI 10.1038/s41467-018-06961-0.

7. Dong Z., Wang H., Chen H., Jiang H., Yuan J., Yang Z., Wang W.-J., Xu F., Guo X., Cao Y., Zhu Z., Geng C., Cheung W.C., Kwok Y.K., Yang H., Leung T.Y., Morton C.C., Cheung S.W., Choy K.W. Identification of balanced chromosomal rearrangements previously unknown among participants in the 1000 Genomes Project: implications for interpretation of structural variation in genomes and the future of clinical cytogenetics. Genet. Med. 2018;20(7):697-707. DOI 10.1038/gim.2017.170. Epub 2017. Nov. 2.

8. Fishman V.S., Salnikov P.A., Battulin N.R. Interpreting chromosomal rearrangements in the context of 3-dimentional genome organization: a practical guide for medical genetics. Biochemistry (Mosc.). 2018;83(4):393-401. DOI 10.1134/S0006297918040107.

9. Gridina M., Mozheiko E., Valeev E., Nazarenko L.P., Lopatkina M.E., Markova Z.G., Yablonskaya M.I., Voinova V.Y., Shilova N.V., Lebedev I.N., Fishman V. A cookbook for DNase Hi-C. Epigenetics Chromatin. 2021;14(1):15. DOI 10.1186/s13072-021-00389-5.

10. Hakim O., Resch W., Yamane A., Klein I., Kieffer-Kwon K.-R., Jankovic M., Oliveira T., Bothmer A., Voss T.C., Ansarah-Sobrinho C., Mathe E., Liang G., Cobell J., Nakahashi H., Robbiani D.F., Nussenzweig A., Hager G.L., Nussenzweig M.C., Casellas R. DNA damage defines sites of recurrent chromosomal translocations in B lymphocytes. Nature. 2012;484(7392):69-74. DOI 10.1038/nature10909.

11. Harewood L., Kishore K., Eldridge M.D., Wingett S., Pearson D., Schoenfelder S., Collins V.P., Fraser P. Hi-C as a tool for precise detection and characterisation of chromosomal rearrangements and copy number variation in human tumours. Genome Biol. 2017; 18(1):125. DOI 10.1186/s13059-017-1253-8.

12. Lieberman-Aiden E., van Berkum N.L., Williams L., Imakaev M., Ragoczy T., Telling A., Amit I., Lajoie B.R., Sabo P.J., Dorschner M.O., Sandstrom R., Bernstein B., Bender M.A., Groudine M., Gnirke A., Stamatoyannopoulos J., Mirny L.A., Lander E.S., Dekker J. Comprehensive mapping of long range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 2009;326(5950):289-293. DOI 10.1126/science.1181369.

13. Malentacchi F., Ciniselli C.M., Pazzagli M., Verderio P., Barraud L., Hartmann C.C., Pizzamiglio S., Weisbuch S., Wyrich R., Gelmini S. Influence of pre-analytical procedures on genomic DNA integrity in blood samples: the SPIDIA experience. Clin. Chim. Acta. 2015;440: 205-210. DOI 10.1016/j.cca.2014.12.004.

14. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 1984;247(3):C125-C142. DOI 10.1152/ajpcell.1984.247.3.C125.

15. Melo U.S., Schöpflin R., Acuna-Hidalgo R., Mensah M.A., Fischer-Zirnsak B., Holtgrewe M., Klever M.-K., Türkmen S., Heinrich V.,

16. Pluym I.D., Matoso E., Bernardo de Sousa S., Louro P., Hülsemann W., Cohen M., Dufke A., Latos-Bieleńska A., Vingron M., Kalscheuer V., Quintero-Rivera F., Spielmann M., Mundlos S. Hi-C identifies complex genomic rearrangements and TAD-shuffling in developmental diseases. Am. J. Hum. Genet. 2020;106(6):872-884. DOI 10.1016/j.ajhg.2020.04.016.

17. Mozheiko E.A., Fishman V.S. Detection of point mutations and chromosomal translocations based on massive parallel sequencing of enriched 3C libraries. Russ. J. Genet. 2019;55(10):1273-1281. DOI 10.1134/S1022795419100089.

18. Narayanan S., O’Donovan M.R., Duthie S.J. Lysis of whole blood in vitro causes DNA strand breaks in human lymphocytes. Mutagenesis. 2001;16(6):455-459. DOI 10.1093/mutage/16.6.455.

19. Nederhand R.J., Droog S., Kluft C., Simoons M.L., De Maat M.P.M., Investigators of the EUROPA trial. Logistics and quality control for DNA sampling in large multicenter studies. J. Thromb. Haemost. 2003;1(5):987-991. DOI 10.1046/j.1538-7836.2003.00216.x.

20. Palmirotta R., Ludovici G., De Marchis M.L., Savonarola A., Leone B., Spila A., De Angelis F., Della Morte D., Ferroni P., Guadagni F. Preanalytical procedures for DNA studies: the experience of the interinstitutional multidisciplinary BioBank (BioBIM). Biopreserv. Biobank. 2011;9(1):35-45. DOI 10.1089/bio.2010.0027.

21. Peng L., Wang S., Yin S., Li C., Li Z., Wang S., Liu Q. Autophosphorylation of H2AX in a cell-specific frozen dependent way. Cryobiology. 2008;57(2):175-177. DOI 10.1016/j.cryobiol.2008.06.005.

22. Permenter J., Ishwar A., Rounsavall A., Smith M., Faske J., Sailey C.J., Alfaro M.P. Quantitative analysis of genomic DNA degradation in whole blood under various storage conditions for molecular diagnostic testing. Mol. Cell. Probes. 2015;29(6):449-453. DOI 10.1016/j.mcp.2015.07.002.

23. Rao S.S.P., Huntle M.H., Durand N.C., Stamenova E.K., Bochkov I.D., Robinson J.T., Sanborn A.L., Machol I., Omer A.D., Lander E.S., Aiden E.L. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 2014;159(7):1665-1680. DOI 10.1016/j.cell.2014.11.021.

24. Ross K.S., Haites N.E., Kelly K.F. Repeated freezing and thawing of peripheral blood and DNA in suspension: effects on DNA yield and integrity. J. Med. Genet. 1990;27(9):569-570. DOI 10.1136/jmg.27.9.569.

25. Schröder C., Steimer W. gDNA extraction yield and methylation status of blood samples are affected by long-term storage conditions. PLoS One. 2018;13(2):e0192414. DOI 10.1371/journal.pone.0192414.