Влияние коэкспрессии тиоредоксина и прохимозина на рефолдинг рекомбинантного химозина альпака

Молокосвертывающий фермент химозин является представителем группы аспартатных протеиназ. Химозин – основной компонент сычужного фермента, традиционно получаемого из желудков телят-молокопоек и широко используемого для свертывания молока при производстве разнообразных видов сыра. Другой источник химозина, не требующий умерщвления животных, базируется на технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантный химозин альпака обладает рядом ценных технологических свойств, делающих его привлекательным для использования в сыроделии в качестве альтернативы рекомбинантному химозину коровы. Цель настоящей работы – исследование влияния коэкспрессии тиоредоксина и прохимозина на рефолдинг рекомбинантного зимогена и активность химозина альпака. Для достижения поставленной цели на основе плазмиды pET32a был сконструирован экспрессионный вектор, содержащий ген тиоредоксина А, слитый с N-концевой последовательностью зимогена маркерного фермента – прохимозина альпака. С помощью сконструированного вектора pET-TrxProChn создан штамм-продуцент рекомбинантного химерного белка тиоредоксин-прохимозин. Выбор прохимозина в качестве модельного белка обусловлен способностью этого зимогена к автокаталитической активации, при которой происходит удаление профрагмента вместе с присоединенной к нему последовательностью тиоредоксина с образованием активного химозина. Показано, что штамм Escherichia coli BL21, трансформированный плазмидой pET-TrxProChn, обеспечивает эффективный синтез химерной молекулы тиоредоксин-прохимозин. Однако химерный белок накапливается в тельцах включения в нерастворимой форме. Поэтому для создания активного целевого фермента была использована процедура ренатурации. Присоединение тиоредоксина, обладающего способностью восстанавливать дисульфидные связи, к N-концевой последовательности прохимозина обеспечивает оптимальные условия для рефолдинга зимогена и увеличивает выход рекомбинантного химозина альпака сразу после активации и при длительном хранении на 13 и 15 % соответственно. Включение тиоредоксина в состав химерного белка, по всей видимости, способствует процессу корректного восстановления дисульфидных связей в молекуле прохимозина, что отражается на динамике роста молоко свертывающей активности химозина альпака при длительном хранении.

1. Baeshen M.N., Al-Hejin A.M., Bora R.S., Ahmed M.M.M., Ramadan H.A.I., Saini K.S., Baeshen N.A., Redwan E.M. Production of biopharmaceuticals in E. coli: Current scenario and future perspectives. J. Microbiol. Biotechnol. 2015;25(7):953-962. DOI 10.4014/jmb.1412.12079.

2. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 1999;10(5):411-421. DOI 10.1016/S0958-1669(99)00003-8.

3. Belenkaya S.V., Bondar A.A., Kurgina T.A., Elchaninov V.V., Bakulina A.Yu., Rukhlova E.A., Lavrik O.I., Ilyichev A.A., Shcherbakov D.N. Characterization of the Altai maral chymosin gene, production of a chymosin recombinant analog in the prokaryotic expression system, and analysis of its several biochemical properties. Biochemistry (Moscow). 2020a;85(7):781-791. DOI 10.1134/S0006297920070068.

4. Belenkaya S.V., Rudometov A.P., Shcherbakov D.N., Balabova D.V., Kriger A.V., Belov A.N., Koval A.D., Elchaninov V.V. Biochemical properties of recombinant chymosin in alpaca (Vicugna pacos L.). Appl. Biochem. Microbiol. 2018;54(6):569-576. DOI 10.1134/S0003683818060054.

5. Belenkaya S.V., Shcherbakov D.N., Balabova D.V., Belov A.N., Ko- val A.D., Elchaninov V.V. Production of maral (Cervus elaphus sibiricus Severtzov) recombinant chymosin in the prokaryotic expression system and the study of the aggregate of its biochemical properties relevant for the cheese­making industry. Appl. Biochem. Microbiol. 2020b;56(6):647-656. DOI 10.1134/S0003683820060034.

6. Bessette P.H., Åslund F., Beckwith J., Georgiou G. Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999;96(24):13703-13708. DOI 10.1073/pnas.96.24.13703.

7. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein­dye binding. Anal. Biochem. 1976;72(1-2):248-254. DOI 10.1016/0003-2697(76)90527-3.

8. Chen H., Zhang G., Zhang Y., Dong Y., Yang K. Functional implications of disulfide bond, Cys206−Cys210, in recombinant prochymosin (chymosin). Biochemistry. 2000;39(40):12140-12148. DOI 10.1021/bi000976o.

9. Chen R. Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and beyond. Biotechnol. Adv. 2012;30(5):1102-1107. DOI 10.1016/j.biotechadv.2011.09.013.

10. Emamipour N., Vossoughi M., Mahboudi F., Golkar M., Fard-Esfa- hani P. Soluble expression of IGF1 fused to DsbA in SHuffle ™ T7 strain: optimization of expression and purification by Box-Behnken design. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019;103(8):3393-3406. DOI 10.1007/s00253-019-09719-w.

11. Hayat S.M., Farahani N., Golichenari B., Sahebkar A. Recombinant protein expression in Escherichia coli (E. coli): what we need to know. Curr. Pharm. Des. 2018;24(6):718-725. DOI 10.2174/1381612824666180131121940.

12. Huang C.J., Lin H., Yang X. Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2012;39(3):383-399. DOI 10.1007/s10295-011-1082-9.

13. Jurado P., de Lorenzo V., Fernández L.A. Thioredoxin fusions increase folding of single chain Fv antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli: Evidence that chaperone activity is the prime effect of thioredoxin. J. Mol. Biol. 2006;357(1):49-61. DOI 10.1016/j.jmb.2005.12.058.

14. Li M., Su Z.G., Janson J.C. In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Expr. Purif. 2004;33(1):1-10. DOI 10.1016/j.pep.2003.08.023.

15. Li Y., Sousa R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 2012;82(1):162-167. DOI 10.1016/j.pep.2011.12.008.

16. Liang C., Li Y., Liu Z., Wu W., Hu B. Protein aggregation formed by recombinant cp19k homologue of Balanus albicostatus combined with an 18 kDa N-terminus encoded by pET-32a(+) plasmid having adhesion strength comparable to several commercial glues. PLoS One. 2015;10(8):e0136493. DOI 10.1371/journal.pone.0136493.

17. Marciniszyn J., Huang J.S., Hartsuck J.A., Tang J. Mechanism of intramolecular activation of pepsinogen. Evidence for an intermediate δ and the involvement of the active site of pepsin in the intramolecular activation of pepsinogen. J. Biol. Chem. 1976;251(22):7095-7102. DOI 10.1016/s0021-9258(17)32946-0.

18. Nara T.Y., Togashi H., Sekikawa C., Kawakami M., Yaginuma N., Saka guchi K., Mizukami F., Tsunoda T. Use of zeolite to refold a disulfide-bonded protein. Colloids Surf. B Biointerfaces. 2009;68(1):68-73. DOI 10.1016/j.colsurfb.2008.09.012.

19. Rosano G.L., Ceccarelli E.A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front. Microbiol. 2014;5:172. DOI 10.3389/fmicb.2014.00172.

20. Rosano G.L., Morales E.S., Ceccarelli E.A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Sci. 2019;28(8):1412-1422. DOI 10.1002/pro.3668.

21. Sakono M., Kawashima Y.M., Ichinose H., Maruyama T., Kamiya N., Goto M. Efficient refolding of inclusion bodies by reversed micelles. Biotechnol. Prog. 2004;20(6):1783-1787. DOI 10.1252/kakoronbunshu.30.468.

22. Studier F.W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 1990;185:60-89. DOI 10.1016/0076-6879(90)85008-C.

23. Tang B., Zhang S., Yang K. Assisted refolding of recombinant prochymosin with the aid of protein disulphide isomerase. Biochem. J. 1994;301(1):17-20. DOI 10.1042/bj3010017.

24. Wei C., Zhang Y., Yang K. Chaperone-mediated refolding of recombinant prochymosin. J. Protein Chem. 2000;19(6):449-456. DOI 10.1023/a:1026593113633.