Инактивация компонентов комплекса TIM приводит к снижению уровня импорта ДНК в митохондрии арабидопсиса

Феномен импорта ДНК в митохондрии показан для всех основных групп эукариот. В растениях и животных импорт ДНК, по-видимому, происходит различными путями. Известно, что в растительные органеллы нуклеиновые кислоты попадают по альтернативным каналам в зависимости от размера импортируемых молекул. Импорт ДНК небольшого размера (до 300 п. н.) частично перекрывается с механизмом импорта тРНК, по крайней мере, на уровне внешней мембраны. Примечательно, что у растений в импорт тРНК вовлечены компоненты аппарата импорта белков, чья роль в транспорте ДНК до настоящего времени оставалась неизученной. В настоящей работе мы провели исследование роли отдельных компонентов транслоказы внутренней мембраны TIM в процессе импорта ДНК в изолированные митохондрии арабидопсиса и их возможной связи с порином VDAC1. С использованием нокаут-мутантов по генам, кодирующим изоформы белков Tim17 или Tim23, мы впервые показали участие этих белков в импорте фрагментов ДНК разной длины. Кроме того, ингибирование транспортных каналов специфическими антителами к VDAC1 приводило к снижению уровня импорта ДНК в митохондрии дикого типа, что позволило установить специфическое участие этой изоформы порина в импорте ДНК. В нокаут-мутанте tim17-1 происходило дополнительное снижение эффективности импорта ДНК в присутствии антител к VDAC1 в сравнении с линией дикого типа. Полученные результаты указывают на участие белков Tim17-1 и Tim23-2 в аппарате импорта ДНК в растительные митохондрии. При этом Tim23-2 может быть часть канала, формируемого при участии VDAC1, в то время как Tim17-1, по-видимому, вовлечен в альтернативный, независимый от VDAC1, путь импорта ДНК. Выявление мембранных белков-переносчиков, участвующих в различных путях импорта ДНК, позволит использовать природную способность митохондрий к поглощению ДНК в качестве удобного биотехнологического инструмента для трансформации митохондриального генома.

1. Fuchs P., Rugen N., Carrie C., Elsasser M., Finkemeier I., Giese J., Hildebrandt T.M., Kuhn K., Maurino V.G., Ruberti C., Schallenberg-Rüdinger M., Steinbeck J., Braun H.P., Eubel H., Meyer E.H., Müller-Schüssele S.J., Schwarzländer M. Single organelle function and organization as estimated from Arabidopsis mitochondrial proteomics. Plant J. 2020;101(2):420-441. https://doi.org/10.1111/tpj.14534

2. Hemono M., Ubrig É., Azeredo K., Salinas-Giegé T., Drouard L., Du chêne A.-M. Arabidopsis voltage-dependent anion channels (VDACs): overlapping and specific functions in mitochondria. Cells. 2020; 9(4):1023. https://doi.org/10.3390/cells9041023

3. Islas-Osuna M.A., Silva-Moreno B., Caceres-Carrizosa N., GarcíaRob les J.M., Sotelo-Mundo R.R., Yepiz-Plascencia G.M. Editing of the grapevine mitochondrial cytochrome b mRNA and molecular modeling of the protein. Biochimie. 2006;88(5):431-435. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2005.10.003

4. Konstantinov Y.M., Dietrich A., Weber-Lotfi F., Ibrahim N., Klimenko E.S., Tarasenko V.I., Bolotova T.A., Koulintchenko M.V. DNA import into mitochondria. Biochemistry (Mosc.). 2016;81(10):1044- 1056. https://doi.org/10.1134/S0006297916100035

5. Koulintchenko M., Konstantinov Y., Dietrich A. Plant mitochondria actively import DNA via the permeability transition pore complex. EMBO J. 2003;22(6):1245-1254. https://doi.org/10.1093/emboj/cdg128

6. Koulintchenko M., Temperley R.J., Mason P.A., Dietrich A., Lightowlers R.N. Natural competence of mammalian mitochondria allows the molecular investigation of mitochondrial gene expression. Hum. Mol. Genet. 2006;15(1):143-154. https://doi.org/10.1093/hmg/ddi435 Larosa V., Remacle C. Transformation of the mitochondrial genome. Int. J. Dev. Biol. 2013;57(6-8):659-665. https://doi.org/10.1387/ijdb.130230cr

7. Lister R., Chew O., Lee M.N., Heazlewood J.L., Clifton R., Parker K.L., Millar A.H., Whelan J. A transcriptomic and proteomic characterization of the Arabidopsis mitochondrial protein import apparatus and its response to mitochondrial dysfunction. Plant Physiol. 2004;134(2):777-789. https://doi.org/10.1104/pp.103.033910

8. Martin W.F., Garg S., Zimorski V. Endosymbiotic theories for eukaryote origin. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015;370(1678): 20140330. https://doi.org/10.1098/rstb.2014.0330

9. Morley S.A., Nielsen B.L. Plant mitochondrial DNA. Front. Biosci. 2017;22(6):1023-1032. https://doi.org/10.2741/4531

10. Murcha M.W., Lister R., Ho A.Y., Whelan J. Identification, expression, and import of components 17 and 23 of the inner mitochondrial membrane translocase from Arabidopsis. Plant Physiol. 2003; 131(4):1737-1747. https://doi.org/10.1104/pp.102.016808

11. Murcha M.W., Elhafez D., Millar A.H., Whelan J. The C-terminal region of TIM17 links the outer and inner mitochondrial membranes in Arabidopsis and is essential for protein import. J. Biol. Chem. 2005;280(16):16476-16483. https://doi.org/10.1074/jbc.M413299200

12. Murcha M.W., Elhafez D., Lister R., Tonti-Filippini J., Baumgartner M., Philippar K., Carrie C., Mokranjac D., Soll J., Whelan J. Characterization of the preprotein and amino acid transporter gene family in Arabidopsis. Plant Physiol. 2007;143(1):199-212. https://doi.org/10.1104/pp.106.090688

13. Murcha M.W., Wang Y., Narsai R., Whelan J. The plant mitochondrial protein import apparatus: the differences make it interesting. Biochim. Biophys. Acta. 2014;1840(4):1233-1245. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.09.026

14. Ryan K.R., Leung R.S., Jensen R.E. Characterization of the mitochondrial inner membrane translocase complex: the Tim23p hydrophobic domain interacts with Tim17p but not with other Tim23p molecules. Mol. Cell. Biol. 1998;18(1):178-187. https://doi.org/10.1128/MCB.18.1.178

15. Salinas T., El Farouk-Ameqrane S., Ubrig E., Sauter C., Duchene A.M., Marechal-Drouard L. Molecular basis for the differential interaction of plant mitochondrial VDAC proteins with tRNAs. Nucleic Acids Res. 2014;42(15):9937-9948. https://doi.org/10.1093/nar/gku728

16. Salinas-Giegé T., Giegé R., Giegé P. tRNA biology in mitochondria. Int. J. Mol. Sci. 2015;16(3):4518-4559. https://doi.org/10.3390/ijms16034518

17. Sweetlove L.J., Taylor N.L., Leaver C.J. Isolation of intact, functional mitochondria from the model plant Arabidopsis thaliana. In: Leister D., Herrmann J.M. (Eds.). Mitochondria. Methods in Molecular Biology™. Vol. 372. Humana Press, 2007;125-136. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-365-3_9

18. Tarasenko T.A., Tarasenko V.I., Koulintchenko M.V., Klimenko E.S., Konstantinov Y.M. DNA import into plant mitochondria: complex approach for in organello and in vivo studies. Biochemistry (Mosc.). 2019;84(7):817-828. https://doi.org/10.1134/S0006297919070113

19. Tarasenko T.A., Klimenko E.S., Tarasenko V.I., Koulintchenko M.V., Dietrich A., Weber-Lotfi F., Konstantinov Y.M. Plant mitochondria import DNA via alternative membrane complexes involving various VDAC isoforms. Mitochondrion. 2021;60:43-58. https://doi.org/10.1016/j.mito.2021.07.006

20. Tateda C., Watanabe K., Kusano T., Takahashi Y. Molecular and genetic characterization of the gene family encoding the voltage-dependent anion channel in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 2011;62(14):4773-4785. https://doi.org/10.1093/jxb/err113

21. Truscott K.N., Kovermann P., Geissler A., Merlin A., Meijer M., Driessen A.J., Rassow J., Pfanner N., Wagner R. A presequence- and voltage-sensitive channel of the mitochondrial preprotein translocase formed by Tim23. Nat. Struct. Biol. 2001;8(12):1074-1082. https://doi.org/10.1038/nsb726

22. Verechshagina N.A., Konstantinov Y.M., Kamenski P.A., Mazunin I.O. Import of proteins and nucleic acids into mitochondria. Biochemistry (Mosc.). 2018;83(6):643-661. https://doi.org/10.1134/S0006297918060032

23. Wang Y., Carrie C., Giraud E., Elhafez D., Narsai R., Duncan O., Whelan J., Murcha M.W. Dual location of the mitochondrial preprotein transporters B14.7 and Tim23-2 in complex I and the TIM17:23 complex in Arabidopsis links mitochondrial activity and biogenesis. Plant Cell. 2012;24(6):2675-2695. https://doi.org/10.1105/tpc.112.098731

24. Wang Y., Law S.R., Ivanova A., van Aken O., Kubiszewski-Jakubiak S., Uggalla V., van der Merwe M., Duncan O., Narsai R., Whelan J., Murcha M.W. The mitochondrial protein import component, TRANSLOCASE OF THE INNER MEMBRANE17-1, plays a role in defining the timing of germination in Arabidopsis. Plant Physiol. 2014;166(3):1420-1435. https://doi.org/10.1104/pp.114.245928

25. Weber-Lotfi F., Ibrahim N., Boesch P., Cosset A., Konstantinov Y., Lightowlers R.N., Dietrich A. Developing a genetic approach to investigate the mechanism of mitochondrial competence for DNA import. Biochim. Biophys. Acta. 2009;1787(5):320-327. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2008.11.001

26. Weber-Lotfi F., Koulintchenko M.V., Ibrahim N., Hammann P., Mileshina D.V., Konstantinov Y.M., Dietrich A. Nucleic acid import into mitochondria: New insights into the translocation pathways. Biochim. Biophys. Acta. 2015;1853(12):3165-3181. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2015.09.011

27. Wu F.-H., Shen S.-C., Lee L.-Y., Chan M.-T., Lin C.-S. Tape-Arabidopsis sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 2009;5:16. https://doi.org/10.1186/1746-4811-5-16