Регуляторные эффекты (p)ppGpp и индола на синтез цАМФ в клетках Escherichia coli

Адаптивный ответ бактерий на стрессорное воздействие условий среды формируется за счет изменения генно-экспрессионного профиля клетки посредством функционирования регуляторных сетей. Сигналами в них выступают естественные метаболиты клетки, в частности индол, а также вторичные мессенджеры (p)ppGpp и цАМФ, взаимное влияние которых недостаточно изучено и представляет собой цель данного исследования. Родительский штамм E. coli BW25141 ((p)ppGpp⁺) и нокаут BW25141ΔrelAΔspoT ((p)ppGpp⁰), не способный синтезировать (p)ppGpp, культивировали на среде М9 с различным содержанием глюкозы (5.6 и 22.2 мМ), в присутствии триптофана в качестве субстрата для синтеза индола и в его отсутствие. Содержание глюкозы измеряли глюкозооксидазным методом, уровень индола – при помощи ВЭЖХ, концентрацию цАМФ – методом ELISA. Начало возрастания исходно низкого внутриклеточного содержания цАМФ совпадало с исчерпанием глюкозы в среде. Максимальный уровень накопления цАМФ в клетках был пропорционален концентрации исходно добавленной глюкозы. При этом (p)ppGpp⁰ мутант демонстрировал снижение максимального уровня цАМФ по сравнению с (p)ppGpp⁺ родителем, наиболее выраженное на среде с 22.2 мМ глюкозы. Таким образом, (p)ppGpp положительно регулирует образование цАМФ. Известно, что промотор триптофаназного оперона, ответственного за биосинтез индола, находится под положительным контролем механизма катаболитной репрессии. Поэтому в клетках (p)ppGpp⁺ штамма в условиях низкой скорости спонтанного образования индола на бестриптофановой среде значительно усиливался его синтез в ответ на возрастание уровня цАМФ при исчерпании глюкозы, чего не наблюдалось у (p)ppGpp⁰ мутанта с пониженным накоплением цАМФ. При добавке триптофана оба штамма демонстрировали высокую продукцию индола, что сопровождалось снижением уровня накопления цАМФ по сравнению с бестриптофановым контролем. Таким образом, (p)ppGpp при исчерпании глюкозы положительно регулирует накопление цАМФ и индола, который, в свою очередь, снижает образование цАМФ.

1. Amato S.M., Orman M.A., Brynildsen M.P. Metabolic control of persister formation in Escherichia coli. Mol. Cell. 2013;50(4):475-487. DOI 10.1016/j.molcel.2013.04.002

2. Arenz S., Abdelshahid M., Sohmen D., Payoe R., Starosta A.L., Berninghausen O., Hauryliuk V., Beckmann R., Wilson D.N. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Res. 2016;44(13):6471-6481. DOI 10.1093/nar/gkw470

3. Balsalobre C., Johansson J., Uhlin B.E. Cyclic AMP-dependent osmoregulation of crp gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2006;188(16):5935-5944. DOI 10.1128/JB.00235-06

4. Bansal T., Englert D., Lee J., Hegde M., Wood T.K., Jayaraman A. Differential effects of epinephrine, norepinephrine, and indole on Escherichia coli O157: H7 chemotaxis, colonization, and gene expression. Infect. Immun. 2007;75(9):4597-4607. DOI 10.1128/IAI.00630­-07

5. Botsford J.L., Harman J.G. Cyclic AMP in prokaryotes. Microbiol. Rev. 1992;56(1):100-122. DOI 10.1128/mr.56.1.100-122.1992

6. Chant E.L., Summers D.K. Indole signalling contributes to the stable maintenance of Escherichia coli multicopy plasmids. Mol. Microbiol. 2007;63(1):35-43. DOI 10.1111/j.1365-2958.2006.05481.x

7. Chu W., Zere T.R., Weber M.M., Wood T.K., Whiteley M., Hidalgo-Romano B., Valenzuela E.J., McLean R.J.C. Indole production promotes Escherichia coli mixed­culture growth with Pseudomonas aeruginosa by inhibiting quorum signaling. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78(2):411-419. DOI 10.1128/AEM.06396-­11

8. Dalebroux Z.D., Svensson S.L., Gaynor E.C., Swanson M.S. ppGpp conjures bacterial virulence. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74(2): 171-199. DOI 10.1128/MMBR.00046-­09

9. Dalebroux Z.D., Swanson M.S. ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat. Rev. Microbiol. 2012;10(3):203-212. DOI 10.1038/nrmicro2720

10. Datsenko K.A., Wanner B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97(12):6640-6645. DOI 10.1073/pnas.120163297

11. Deutscher J., Francke C., Postma P.W. How phosphotransferase system­related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006;70(4):939­1031. DOI 10.1128/MMBR.00024-­06

12. Duysak T., Tran T.T., Afzal A.R., Jung C. Fluorescence spectroscopic analysis of ppGpp binding to cAMP receptor protein and histonelike nucleoid structuring protein. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(15):7871. DOI 10.3390/ijms22157871

13. Gosset G., Zhang Z., Nayyar S., Cuevas W.A., Saier M.H. Transcriptome analysis of Crp­dependent catabolite control of gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2004;186(11):3516-3524. DOI 10.1128/JB.186.11.3516-3524.2004

14. Gutierrez-Ríos R.M., Freyre-Gonzalez J.A., Resendis O., Collado-Vides J., Saier M., Gosset G. Identification of regulatory network topological units coordinating the genome­wide transcriptional response to glucose in Escherichia coli. BMC Microbiol. 2007;7:53. DOI 10.1186/1471-2180-7-53

15. Hauryliuk V., Atkinson G.S., Murakami K.S., Tenson T., Gerdes K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nat. Rev. Microbiol. 2015;13(5):298-309. DOI 10.1038/nrmicro3448

16. Hengge R., Häussler S., Pruteanu M., Stülke J., Tschowri N., Turgay K. Recent advances and current trends in nucleotide second messenger signaling in bacteria. J. Mol. Biol. 2019;431(5):908-927. DOI 10.1016/j.jmb.2019.01.014

17. Hirakawa H., Inazumi Y., Masaki T., Hirata T., Yamaguchi A. Indole induces the expression of multidrug exporter genes in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 2005;55(4):1113-1126. DOI 10.1111/j.1365-2958.2004.04449

18. Imamura R., Yamanaka K., Ogura T., Hiraga S., Fujita N., Ishihama A., Niki H. Identification of the cpdA gene encoding cyclic 3′,5′-adenosine monophosphate phosphodiesterase in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1996;271(41):25423-25429. DOI 10.1074/jbc.271.41.25423

19. Irving S.E., Corrigan R.M. Triggering the stringent response: signals responsible for activating (p)ppGpp synthesis in bacteria. Microbiology. 2018;164(3):268-276. DOI 10.1099/mic.0.000621

20. Isaacs H., Chao D., Yanofsky C., Saier M.H. Mechanism of catabolite repression of tryptophanase synthesis in Escherichia coli. Microbiology. 1994;140(8):2125-2134. DOI 10.1099/13500872-140-8-2125

21. Ishizuka H., Hanamura A., Inada T., Aiba H. Mechanism of the down-regulation of cAMP receptor protein by glucose in Escherichia coli: role of autoregulation of the crp gene. EMBO J. 1994;13(13):3077-3082. DOI 10.1002/j.1460-2075.1994.tb06606.x

22. Kashevarova N.M., Akhova A.V., Khaova E.A., Tkachenko A.G. Role of alarmone (p)ppGpp in the regulation of indole formation depending on glucose content in Escherichia coli. Acta Biomedica Scientifica. 2022;7(3):162­-168. DOI 10.29413/ABS.2022-7.3.17 (in Russian)

23. Kawamura-Sato K., Shibayama K., Horii T., Iimuma Y., Arakawa Y., Ohta M. Role of multiple efflux pumps in Escherichia coli in indole expulsion. FEMS Microbiol. Lett. 1999;179(2):345-352. DOI 10.1016/S0378­-1097(99)00433-­4

24. Kim D., Sitepu I.R., Hashidokoa Y. Induction of biofilm formation in the betaproteobacterium Burkholderia unamae CK43B exposed to exogenous indole and gallic acid. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79(16):4845-4852. DOI 10.1128/AEM.01209-13

25. Kwan B.W., Osbourne D.O., Hu Y., Benedik M.J., Wood T.K. Phosphodiesterase DosP increases persistence by reducing cAMP which reduces the signal indole. Biotechnol. Bioeng. 2015;112(3):588-600. DOI 10.1002/bit.25456

26. Lee J., Jayaraman A., Wood T.K. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 2007;7:42. DOI 10.1186/1471-­2180-­7-­42

27. Maisonneuve E., Gerdes K. Molecular mechanisms underlying bacterial persisters. Cell. 2014;157(3):539-548. DOI 10.1016/j.cell.2014.02.050

28. Mechold U., Potrykus K., Murphy H., Murakami K.S., Cashel M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2013;41(12):6175-6189. DOI 10.1093/nar/gkt302

29. Oh Y.T., Lee K., Bari W., Raskin D.M., Yoon S.S. (p)ppGpp, a small nucleotide regulator, directs the metabolic fate of glucose in Vibrio cholera. J. Biol. Chem. 2015;290(21):13178-13190. DOI 10.1074/jbc.M115.640466

30. Potrykus K., Cashel M. (p)ppGpp: still magical? Annu. Rev. Microbiol. 2008;62:35-51. DOI 10.1146/annurev.micro.62.081307.162903

31. Rickenberg H.V. Cyclic AMP in prokaryotes. Annu. Rev. Microbiol. 1974;28:353-369. DOI 10.1146/annurev.mi.28.100174.002033

32. Ro C., Cashel M., Fernández­Col L. The secondary messenger ppGpp interferes with cAMP­CRP regulon by promoting CRP acetylation in Escherichia coli. PLoS One. 2021;16(10):e0259067. DOI 10.1371/journal.pone.0259067

33. Sanchez-Vazquez P., Dewey C.N., Kitten N., Ross W., Gourse R.L. Genome-wide effects on Escherichia coli transcription from ppGpp binding to its two sites on RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019;116(17):8310-8319. DOI 10.1073/pnas.1819682116

34. Stewart V., Yanofsky C. Evidence for transcription antitermination control of tryptophanase operon expression in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1985;164(2):731-740. DOI 10.1128/jb.164.2.731-740.1985

35. Traxler M.F., Chang D.E., Conway T. Guanosine 3′,5′-bispyrophosphate coordinates global gene expression during glucose­lactose diauxie in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006;103(7): 2374-2379. DOI 10.1073/pnas.0510995103

36. Traxler M.F., Summers S.M., Nguyen H., Zacharia V.M., Smith J.T., Conway T. The global, ppGpp­mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 2008;68(5): 1128-1148. DOI 10.1111/j.1365-2958.2008.06229.x

37. Wood T.K., Knabel S.J., Kwan B.W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl. Environ. Microbiol. 2013;79(23):7116-­7121. DOI 10.1128/AEM.02636-­13

38. Yanofsky C., Horn V., Gollnick P. Physiological studies of tryptophan transport and tryptophanase operon induction in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1991;173(19):6009-6017. DOI 10.1128/jb.173.19.6009­-6017.1991

39. Yoshimura-Suzuki T., Sagami I., Yokota N., Kurokawa H., Shimizu T. DOS(Ec), a heme-regulated phosphodiesterase, plays an important role in the regulation of the cyclic AMP level in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2005;187(19):6678-6682. DOI 10.1128/JB.187.19.6678-6682.2005

40. Zhang T., Zhu J., Wei S., Luo Q., Li L., Li S., Tucker A., Shao H., Zhou R. The roles of RelA/(p)ppGpp in glucose­starvation induced adaptive response in the zoonotic Streptococcus suis. Sci. Rep. 2016;6:27169. DOI 10.1038/srep27169

41. Zhou X., Meng X., Sun B. An EAL domain protein and cyclic AMP contribute to the interaction between the two quorum sensing systems in Escherichia coli. Cell Res. 2008;18(9):937-948. DOI 10.1038/cr.2008.67