Проявление селекционно-ценных признаков в потомстве мутанта сорго, несущего генетическую конструкцию для РНК-сайленсинга гена γ-кафирина

Улучшение питательной ценности зернового сорго – засухоустойчивой и жаростойкой зерновой культуры, служащей источником кормового и продовольственного зерна во многих засушливых регионах мира, – важная задача селекции в условиях глобального потепления климата. Одной из причин низкой питательной ценности зерна сорго является устойчивость его запасных белков (кафиринов) к протеолитическому расщеплению, обусловленная, в том числе структурной организацией белковых телец, в которых наиболее устойчивый к действию протеаз γ-кафирин располагается по периферии, инкапсулируя более легко перевариваемые α-кафирины. Введение генетических конструкций, способных к индукции РНК-сайленсинга гена γ-кафирина (gKAF1), открывает перспективы для решения этой проблемы. Нами у сорта зернового сорго Аванс посредством агробактериальной трансформации с использованием штамма, несущего в составе Т-ДНК генетическую конструкцию для РНК-сайленсинга гена gKAF1, получен мутант с улучшенной перевариваемостью белков эндосперма (до 92 %). Цель настоящей работы – изучение стабильности наследования введенной генетической конструкции в поколениях Т₂–Т₄, установление числа ее копий, а также проявления важнейших селекционно-ценных признаков у потомства полученного мутанта. Мутантные линии выращивали на экспериментальном участке Федерального аграрного научного центра Юго-Востока в трех рендомизированных блоках. Исследуемые линии характеризовались улучшенной перевариваемостью кафиринов, модифицированным типом эндосперма, полностью или частично лишенным стекловидного слоя, повышенным процентным содержанием лизина (на 75 %), сниженной высотой растений, длиной подметельчатого междоузлия, массой 1000 зерен и урожаем зерна с метелки. В поколении Т₂ отобрана линия с моногенным контролем устойчивости к глюфосинату аммония. Анализ qPCR показал, что у разных растений из поколений Т₃ и Т₄ генетическая конструкция присутствует в двух-четырех копиях. В поколении Т₃ отобрана линия с высокой перевариваемостью белков эндосперма (81 %) и минимальным снижением селекционно-ценных признаков (на 5–7 %).

1. Aboubacar A., Axtell J.D., Huang C.P., Hamaker B.R. A rapid protein digestibility assay for identifying highly digestible sorghum lines. Cereal Chem. 2001;78(2):160-165. DOI 10.1094/CCHEM.2001.78.2.160

2. Bharathi J.K., Anandan R., Benjamin L.K., Muneer S., Prakash M.A.S. Recent trends and advances of RNA interference (RNAi) to improve agricultural crops and enhance their resilience to biotic and abiotic stresses. Plant Physiol. Biochem. 2023;194:600-618. DOI 10.1016/j.plaphy.2022.11.035

3. Borisenko N., Elkonin L., Kenzhegulov O. Inheritance of the genetic construct for RNA-silencing of the γ-kafirin gene (gKAF1) in the progeny of transgenic sorghum plants. BIO Web Conf. 2022;43: 03015. DOI 10.1051/bioconf/20224303015

4. Casu R.E., Selivanova A., Perroux J.M. High-throughput assessment of transgene copy number in sugarcane using real-time quantitative PCR. Plant Cell Rep. 2012;31(1):167-177. DOI 10.1007/s00299-011-1150-7

5. Chiang H.H., Hwang I., Goodman H.M. Isolation of the Arabidopsis GA4 locus. Plant Cell. 1995;7(2):195-201. DOI 10.1105/tpc.7.2.195

6. da Silva L.S. Transgenic sorghum: Effects of altered kafirin synthesis on kafirin polymerisation, protein quality, protein body structure and endosperm texture. Thesis. Pretoria: University of Pretoria South Africa, 2012

7. da Silva L.S., Taylor J., Taylor J.R.N. Transgenic sorghum with altered kafirin synthesis: kafirin solubility, polymerization, and protein digestion. J. Agric. Food Chem. 2011a;59(17):9265-9270. DOI 10.1021/jf201878p

8. da Silva L.S., Jung R., Zhao Z., Glassman K., Grootboom A.W., Mehlo L., O’Kennedy M.M., Taylor J., Taylor J.R.N. Effect of suppressing the synthesis of different kafirin subclasses on grain endosperm texture, protein body structure and protein nutritional quality in improved sorghum lines. J. Cereal Sci. 2011b;54(1):160-167. DOI 10.1016/j.jcs.2011.04.009

9. Deineko E.V., Zagorskaya A.A., Shumny V.K. T-DNA-induced mutations in transgenic plants. Russ. J. Genet. 2007;43(1):1-11. DOI 10.1134/S1022795407010012

10. de Mesa-Stonestreet N.J., Alavi S., Bean S.R. Sorghum proteins: the concentration, isolation, modification, and food applications of kafirins. J. Food Sci. 2010;75(5):90-104. DOI 10.1111/j.1750-3841.2010.01623.x

11. Duressa D., Weerasoriya D., Bean S.R., Tilley M., Tesso T. Genetic basis of protein digestibility in grain sorghum. Crop Sci. 2018;58(6): 2183-2199. DOI 10.2135/cropsci2018.01.0038

12. Elkonin L.A., Italianskaya J.V., Fadeeva I.Yu., Bychkova V.V., Kozhemyakin V.V. In vitro protein digestibility in grain sorghum: effect of genotype and interaction with starch digestibility. Euphytica. 2013; 193:327-337. DOI 10.1007/s10681-013-0920-4

13. Elkonin L.A., Domanina I.V., Ital’yanskaya Yu.V. Genetic engineering as a tool for modification of seed storage proteins and improvement of nutritional value of cereal grain. Agricult. Biol. 2016a;51(1): 17-30. DOI 10.15389/agrobiology.2016.1.17eng

14. Elkonin L.A., Italianskaya J.V., Domanina I.V., Selivanov N.Y., Rakitin A.L., Ravin N.V. Transgenic sorghum with improved digestibility of storage proteins obtained by Agrobacterium-mediated transformation. Russ. J. Plant Physiol. 2016b;63(5):678-689. DOI 10.1134/S1021443716050046

15. Elkonin L.A., Panin V.M., Kenzhegulov O.A., Sarsenova S.Kh. RNAi-mutants of Sorghum bicolor (L.) Moench with improved digestibility of seed storage proteins. In: Jimenez-Lopez J.C. (Ed.). Grain and Seed Proteins Functionality. London: Intech Open Ltd., 2021;1-17. DOI 10.5772/intechopen.96204

16. Feldmann K.A., Marks M.D., Christianson M.L., Quatrano R.S. A Dwarf mutant of Arabidopsis generated by T-DNA insertion mutagenesis. Science. 1989;243(4896):1351-1354. DOI 10.1126/science.243.4896.1351

17. Grootboom A.W., Mkhonza N.L., Mbambo Z., O’Kennedy M.M., da Silva L.S., Taylor J., Taylor J.R.N., Chikwamba R., Mehlo L. Co-suppression of synthesis of major α-kafirin sub-class together with γ-kafirin-1 and γ-kafirin-2 required for substantially improved protein digestibility in transgenic sorghum. Plant Cell Rep. 2014; 33(3):521-537. DOI 10.1007/s00299-013-1556-5

18. Guo Q., Liu Q., Smith N.A., Liang G., Wang M.B. RNA silencing in plants: mechanisms, technologies and applications in horticultural crops. Curr. Genomics. 2016;17(6):476-489. DOI 10.2174/1389202917666160520103117

19. Jackson A.L., Bartz S.R., Schelter J., Kobayashi S.V., Burchard J., Mao M., Li B., Cavet G., Linsley P.S. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat. Biotechnol. 2003;21(6): 635-638. DOI 10.1038/nbt831

20. Kumar T., Dweikat I., Sato S., Ge Z., Nersesian N., Chen H., Elthon T., Bean S., Ioerger B.P., Tilley M., Clemente T. Modulation of kernel storage proteins in grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench). Plant Biotechnol. J. 2012;10:533-544. DOI 10.1111/j.1467-7652.2012.00685.x

21. Muhammad T., Zhang F., Zhang Y., Liang Y. RNA interference: a natural immune system of plants to counteract biotic stressors. Cells. 2019;8(1):38. DOI 10.3390/cells8010038

22. Ndimba R.J., Kruger J., Mehlo L., Barnabas A., Kossmann J., Ndimba B.K. A comparative study of selected physical and biochemical traits of wild-type and transgenic sorghum to reveal differences relevant to grain quality. Front. Plant Sci. 2017;8:952. DOI 10.3389/fpls.2017.00952

23. Nunes A., Correia I., Barros A., Delgadillo I. Sequential in vitro pepsin digestion of uncooked and cooked sorghum and maize samples. J. Agric. Food Chem. 2004;52(7):2052-2058. DOI 10.1021/jf0348830

24. Oria M.P., Hamaker B.R., Axtell J.D., Huang C.P. A highly digestible sorghum mutant cultivar exhibits a unique folded structure of endosperm protein bodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97(10): 5065-5070. DOI 10.1073/pnas.080076297

25. Ram H., Soni P., Salvi P., Gandass N., Sharma A., Kaur A., Sharma T.R. Insertional mutagenesis approaches and their use in rice for functional genomics. Plants. 2019;8(9):310. DOI 10.3390/plants8090310

26. Senthil-Kumar M., Mysore K.S. Caveat of RNAi in plants: the off-target effect. Methods Mol. Biol. 2011;744:13-25. DOI 10.1007/978-1-61779-123-9_2

27. Smith N.A., Singh S.P., Wang M.-B., Stoutjesdijk P., Green A., Waterhouse P.M. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 2000;407(6802):319-320. DOI 10.1038/35030305

28. Tesso T., Ejeta G., Chandrashekar A., Huang C.P., Tandjung A., Lewamy M., Axtell J., Hamaker B.R. A novel modified endosperm texture in a mutant high-protein digestibility/high-lysine grain sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench). Cereal Chem. 2006;83(2):194-201. DOI 10.1094/CC-83-0194

29. Wang L., Gao L., Liu G., Meng R., Liu Y., Li J. An efficient sorghum transformation system using embryogenic calli derived from mature seeds. PeerJ. 2021;9:e11849. DOI 10.7717/peerj.11849

30. Wilson A.K., Latham J.R., Steinbrecher R.A. Transformation-induced mutations in transgenic plants: Analysis and biosafety implications. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2006;23:209-238. DOI 10.1080/02648725.2006.10648085

31. Wong J.H., Lau T., Cai N., Singh J., Pedersen J.F., Vensel W.H., Hurkman W.J., Wilson J.D., Lemaux P.G., Buchanan B.B. Digestibility of protein and starch from sorghum (Sorghum bicolor) is linked to biochemical and structural features of grain endosperm. J. Cereal Sci. 2009;49(1):73-82. DOI 10.1016/j.jcs.2008.07.013

32. Zhuravlyov V.S., Dolgikh V.V., Timofeev S.A., Gannibal F.B. RNA interference method in plant protection against insect pests. Vestnik Zashchity Rastenij = Plant Protection News. 2022;105(1):28-39. DOI 10.31993/2308-6459-2022-105-1-15219 (in Russian)