Halo-RPD: в поисках мишеней РНК-связывающих белков растений

Изучение РНК-белковых взаимодействий и идентификация РНК-мишеней относятся к важнейшим аспектам понимания биологии РНК. К настоящему времени предложены различные методы изучения таких взаимодействий; одним из широко распространенных является иммунопреципитация РНК (RIP). Большинство работ по поиску РНК-мишеней было проведено с использованием антител непосредственно на эндогенный белок или же на GFP, слитый с целевым белком. Зависимость от уровня экспрессии целевого белка и подбор специфичных антител значительно затрудняют классическую иммунопреципитацию. Белок же, слитый с GFP, нередко может быть цитотоксичен, что в дальнейшем приведет к его неправильному узнаванию и/или деградации. В последние годы был разработан ряд мультифункциональных тагов, включая SNAP-tag и HaloTag. Такие таги способствуют изучению целевых белков с разных сторон. Для них созданы флуоресцентные красители, способные прочно связываться с определенным участком тага. Это позволяет как изучать наработку химерного белка, так и определять его локализацию непосредственно в клетке или во всем организме. Для таких тагов разработаны также высокоаффинные субстраты, ковалентно связывающие химерные белки, что значительно сокращает потери в ходе выделения. В данной работе представлен метод, основанный на системе HaloTag, который мы назвали Halo-RPD (HaloTag RNA PullDown). В протоколе используются растения со стабильной экспрессией химерного белка и магнитные шарики Magne® HaloTag® Beads для захвата РНК-белковых комплексов непосредственно из цитоплазматического лизата трансгенных растений Arabidopsis thaliana. Приводится описание основных этапов: 1) подготовка магнитных шариков; 2) гомогенизация тканей и отбор контролей; 3) осаждение и отмывка РНК-белковых комплексов; 4) определение эффективности связывания белка; 5) выделение РНК; 6) анализ полученной РНК. Даны рекомендации для планирования эксперимента по высокопроизводительному секвенированию.

1. Banks C.A.S., Boanca G., Lee Z.T., Eubanks C.G., Hattem G.L., PeakA., Weems L.E., Conkright J.J., Florens L., Washburn M.P. TNIP2 is a hub protein in the NF-κB network with both protein and RNA mediated interactions. Mol. Cell. Proteomics. 2016;15(11):3435-3449. DOI 10.1074/mcp.M116.060509

2. Brooks S.A., Rigby W.F.C. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 2000;28(10):e49. DOI 10.1093/nar/28.10.e49

3. Frydrych Capelari É., da Fonseca G.C., Guzman F., Margis R. Circular and micro RNAs from Arabidopsis thaliana flowers are simultaneously isolated from AGO-IP libraries. Plants. 2019;8(9):302. DOI 10.3390/plants8090302

4. Gu J., Wang M., Yang Y., Qiu D., Zhang Y., Ma J., Zhou Y., Hannon G.J., Yu Y. GoldCLIP: gel-omitted ligation-dependent CLIP. Genom. Proteom. Bioinform. 2018;16(2):136-143. DOI 10.1016/j.gpb.2018.04.003

5. Köster T., Meyer K. Plant ribonomics: proteins in search of RNA partners. Trends Plant Sci. 2018;23(4):352-365. DOI 10.1016/j.tplants.2018.01.004

6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-685. DOI 10.1038/227680a0

7. Li X., Pritykin Y., Concepcion C.P., Lu Y., La Rocca G., Zhang M., King B., Cook P.J., Au Y.W., Popow O., Paulo J.A. Otis H.J., Mastroleo C., Ogrodowski P., Schreiner R., Haigis K.M., Betel D., Leslie C.S., Ventura A. High-resolution in vivo identification of miRNA targets by Halo-enhanced Ago2 pull-down. Mol. Cell. 2020; 79(1):167-179. DOI 10.1016/j.molcel.2020.05.009

8. Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C., Wood M.G., Learish R., Ohana R.F., Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F., Wood K.V. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem. Biol. 2008;3(6):373-382. DOI 10.1021/cb800025k

9. Petri R., Jakobsson J. Identifying miRNA targets using AGO-RIPseq. In: Lamandé S. (Ed.) mRNA Decay. Methods in Molecular Biology. Vol. 1720. New York: Humana Press, 2018;131-140. DOI 10.1007/978-1-4939-7540-2_9

10. Ramanathan M., Porter D.F., Khavari P.A. Methods to study RNA-protein interactions. Nat. Methods. 2019;16(3):225-234. DOI 10.1038/s41592-019-0330-1

11. Ren Z., Zhang D., Cao L., Zhang W., Zheng H., Liu Z., Han S., Dong Y., Zhu F., Liu H., Su H., Chen Y., Wu L., Zhu Y., Ku L. Functions and regulatory framework of ZmNST3 in maize under lodging and drought stress. Plant Cell Environ. 2020;43(9):2272-2286. DOI 10.1111/pce.13829

12. Samanta S., Thakur J.K. Characterization of mediator complex and its associated proteins from rice. In: Kaufmann K., Mueller-Roeber B. (Eds.) Plant Gene Regulatory Networks. Methods in Molecular Biology. Vol. 1629. New York: Humana Press, 2017;123-140. DOI 10.1007/978-1-4939-7125-1_9

13. Seo J.S., Chua N.H. Analysis of interaction between long noncoding RNAs and protein by RNA immunoprecipitation in Arabidopsis. In: Chekanova J.A., Wang H.-L.V. (Eds.) Plant Long Non-Coding RNAs. Methods in Molecular Biology. Vol. 1933. New York: Humana Press, 2019;289-295. DOI 10.1007/978-1-4939-9045-0_18

14. Sorenson R., Bailey-Serres J. Rapid immunopurification of ribonucleoprotein complexes of plants. In: Alonso J., Stepanova A. (Eds.) Plant Functional Genomics. Methods in Molecular Biology. Vol. 1284. New York: Humana Press, 2015;209-219. DOI 10.1007/978-1-4939-2444-8_10

15. Steffen A., Elgner M., Staiger D. Regulation of flowering time by the RNA-binding proteins AtGRP7 and AtGRP8. Plant Cell Physiol. 2019;60(9):2040-2050. DOI 10.1093/pcp/pcz124

16. Taranov V.V., Zlobin N.E., Evlakov K.I., Shamustakimova A.O., Babakov A.V. Contribution of Eutrema salsugineum cold shock domain structure to the interaction with RNA. Biochemistry (Moscow). 2018;83(11):1369-1379. DOI 10.1134/S000629791811007X

17. Urh M., Hartzell D., Mendez J., Klaubert D.H., Wood K. Methods for detection of protein–protein and protein–DNA interactions using HaloTagl™. In: Zachariou M. (Ed.) Affinity Chromatography. Methods in Molecular Biology. Vol. 421. New York: Humana Press, 2008;191-210. DOI 10.1007/978-1-59745-582-4_13

18. van Dijk M., Visser A., Buabeng K.M., Poutsma A., van der Schors R.C., Oudejans C.B. Mutations within the LINC-HELLP non-coding RNA differentially bind ribosomal and RNA splicing complexes and negatively affect trophoblast differentiation. Hum. Mol. Genet. 2015; 24(19):5475-5485. DOI 10.1093/hmg/ddv274

19. Xing D., Wang Y., Hamilton M., Ben-Hur A., Reddy A.S. Transcriptome-wide identification of RNA targets of Arabidopsis SERINE/ ARGININE-RICH45 uncovers the unexpected roles of this RNA binding protein in RNA processing. Plant Cell. 2015;27(12):3294-3308. DOI 10.1105/tpc.15.00641