Эффективный метод идентификации штаммов Escherichia coli, выделенных из различных органов домашней птицы (Gallus gallus domesticus)

Выяснение путей распространения инфекции и идентификация источников патогена являются актуальными проблемами в системе профилактических мероприятий, направленных на борьбу с инфекционными заболеваниями человека и животных. Быстрый и точный метод идентификации бактериальных штаммов (генотипирование) позволяет на научной основе планировать противоэпизоотические мероприятия. Несмотря на обилие методов генотипирования микроорганизмов, не существует унифицированного подхода, применимого к разным видам патогенов. В исследовании была поставлена цель – разработать метод генотипирования, позволяющий идентифицировать штаммы E. coli, циркулирующие у кур различных птицефабрик России. Метод основан на ранее выдвинутой нами идее двойного расщепления и избирательного мечения рестрикционных фрагментов ДНК (ДРИМ). Геномная ДНК микроорганизма расщепляется одновременно двумя ферментами рестрикции и метится биотинилированным дезоксицитозинтрифосфатом с помощью ДНК-полимеразы. Ферменты подбираются in silico для каждого вида микроорганизма таким образом, чтобы в результате получить ограниченное число меченых фрагментов ДНК, которые легко разделить в обычном агарозном геле. В ходе выполнения экспериментальной работы на изолятах E. coli были доказаны воспроизводимость метода и его высокая дискриминационная способность. Данный подход был реализован при генотипировании ряда других патогенных микроорганизмов. К числу преимуществ предлагаемого метода относятся быстрота выполнения анализа, доступность реактивов и приборов. Показаны передача возбудителя между курами в пределах одной птицефабрики и возможность присутствия в разных органаходной особи генетически близких штаммов E. coli. Для генотипирования подходят бактериальные изоляты кур, выделенные из любых органов, кроме желудочно-кишечного тракта. В кишечнике присутствуют эндогенные бактериальные штаммы E. coli, что затрудняет интерпретацию результатов генотипирования. В работе показана возможность использования метода ДРИМ на полевых изолятах E. coli для решения вопросов молекулярной эпизоотологии.

1. Борисенкова А.Н., Новикова О.Б., Оконевский П. Флорфеникол в птицеводстве. Птицеводство. 2012;3:43-45.

2. Добрина М.Н. Нужен постоянный контроль сальмонеллеза. Животноводство России. 2011;3:11-13.

3. Жебрун А.Б., Мукомолов С.Л., Нарвская О.В. Генотипирование и молекулярное маркирование бактерий и вирусов в эпидемиологическом надзоре за актуальными инфекциями. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011;4:28-36.

4. Макаров В.В. Истоки и эволюция современной эпизоотологии. Ветеринар. патология. 2007;3:8-17.

5. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипическое и молекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 2005;6:88-93.

6. Bikandi J., SanMillan R Rementeria. A., Garaizar J. In silico analysis of complete bacterial genomes PCR AFLP PCR and endonuclease restriction Bioinformatics. 2004;20(5):798-799.

7. Fakhr M.K., Nolan L.K., Logue C.M. Multilocus sequence typing lacks the discriminatory ability of pulsed-field gel electrophoresis for typing Salmonella enterica serovar Typhimurium J. Clin. Microbiol. 2005; 435):2215-2219.

8. Foxman B., Zhang L., Koopman J.S., Manning S.D., Marrs C.F. Choosing an appropriate bacterial typing technique for epidemiological studies. Epidemiol. Perspect. Innov. 20052(10). DOI: 10.1186/1742- 5573-2-10

9. Higgins J., Hohn C., Hornor S., Frana M. Denver M., Joeger R. Genotyping of Escherichia coli from environment and animal samples. J. Microbiol. Methods. 2007;70(2):227-235.

10. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J. Clin. Microbiol. 198826(11):2465-2466.

11. Hussein A.H., Ghanem I.A., Eid A.A., Ali M.A., Sherwood J.S., Li G., Nolan L.K., Logue C.M. Molecular and phenotypic characterization of Escherichia coli isolated from broiler chicken flocks in Egypt. Avian Dis. 2013;573):602-611.

12. Koort J.M.K., Lukinmaa S., Rantala M. Unkila E., Siitonen A. Technical improvement to prevent DNA degradation of enteric pathogens in pulsed-field gel electrophoresis J. Clin. Microbiol. 200240(9): 3497-3498.

13. Lukinmaa S., Nakari U-M., Eklund M., Siitonen A. Application of molecular genetic methods in diagnostics and epidemiology of foodborne bacterial pathogens APMIS. 2004112(11/):908-929.

14. Lyhs U., Ikonen I., Pohjanvirta K.Raninen K., Perko-Mäkelä P., Pelkonen S.Extraintestinal pathogenic Escherichia coli in poultry meat products on the Finnish retail marketActa Vet. Scand. 20125464). DOI: 10.1186/1751-0147-54-64

15. Mitani N., Koizumi A., Sano R.Masutani T., Murakawa K., Mikasa K., Okamoto Y. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by PCR-RFLP and its usefulness in an epidemiological study of an outbreakJpn. J. Infect. Dis. 2005 58250-252.

16. Terletski V., Schwarz S., Carnwath J., Niemann H. Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovars Choleraesuis, Typhimurium, Dublin and laboratory strains of Escherichia coli using subtracted restriction fingerprinting (SRF). Microbiol. Res. 2003;158135-142.

17. Terletskiy V., Kuhn G., Francioli P., Blanc D. Application and evaluation of double digest selective label (DDSL) typing technique for Pseudomonas aeruginosa hospital isolates J. Microbiol. Methods. 2008283-287.

18. Terletskiy V., Tyshchenko V., Martinez-Ballesteros I. Garaizar J., Bikandi J. Validation of Double Digest Selective Label database for sequenced prokaryotic genomes Bioinformatics. 2010):417-418.

19. Van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N.K., Fussing V., Green J., Feil E., Gerner-Smidt P., Brisse S., Struelens M., Escmid E. Guidelines for the validation and application of typing methods for the use in bacterial epidemiology Clin.

20. Microbial. Infect. 2007:Suppl.31-46.

21. Willse A., Straub T.M., Wunschel S.C. Small J.A., Call D.R., Daly D.S., Chandler D.P. Quantitative oligonucleotide microarray fingerprinting of Salmonella enterica isolatesNucl Acids Res. 2004;32(5): 1848-1856.