Оценка клеточных линий с индуцируемой деплецией компонентов когезина и конденсинов посредством анализа морфологии метафазных хромосом

Одна из самых продуктивных стратегий поиска функций различных белков – исследование последствий потери функции белка. Часто для этого получают клетки или организмы с нокаутом гена, кодирующего белок интереса. Однако многие белки выполняют настолько важные функции, что клетка или организм резко теряют жизнеспособность при потере функции такого белка. Для этих белков наиболее продуктивной стратегией является применение систем индуцируемой деградации белка. Часто используют систему ауксин-зависимой деградации белков. Для применения этой системы достаточно ввести в клетки млекопитающих трансген, кодирующий растительную ауксин-зависимую убиквитин лигазу, и влючить в ген интереса последовательность, кодирующую дегроновый домен. Важный этап создания клеток, способных к индуцируемой деплеции белка, – отбор клеточных клонов с эффективной ауксин-зависимой деградацией белка интереса. Для отбора клонов с индуцируемой деплецией архитектурных белков хроматина RAD21 (компонент когезинового комплекса) и SMC2 (компонент конденсинового комплекса) мы предлагаем использовать морфологию метафазных хромосом как удобный функциональный тест. В данной работе мы получили серию клонов клеток человека HAP1, несущих необходимые генетические конструкции для индуцируемой деплеции RAD21 и SMC2. Эффективность деградации белка интереса была оценена с помощью проточной цитофлуориметрии, Вестерн-блоттинга и теста на морфологию метафазных хромосом. На основе проведенных тестов мы продемонстрировали, что созданные нами клоны с дегроном SMC2 эффективно и полно теряют функцию белка при индукции ауксином. При этом ни один из созданных нами клонов HAP1 с дегроном RAD21 не показал полной потери функции RAD21 при индукции деградации ауксином. Кроме того, некоторые клоны имели признаки потери функции RAD21 даже в отсутствие индукции. Использованный нами тест на морфологию хромосом оказался удобным и информативным для отбора клонов. Результаты этого теста хорошо согласуются с данными проточной цитофлуориметрии анализа и Вестерн-блоттинга. 

1. Baker M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 2015;521(7552):274-276. DOI 10.1038/521274a

2. de Wit E., Nora E.P. New insights into genome folding by loop ex- trusion from inducible degron technologies. Nat. Rev. Genet. 2023; 24(2):73-85. DOI 10.1038/s41576-022-00530-4

3. Gibcus J.H., Samejima K., Goloborodko A., Samejima I., Naumova N., Nuebler J., Kanemaki M.T., Xie L., Paulson J.R., Earnshaw W.C., Mirny L.A., Dekker J. A pathway for mitotic chromosome formation. Science. 2018;359(6376):eaao6135. DOI 10.1126/science.aao6135

4. Kabirova E., Nurislamov A., Shadskiy A., Smirnov A., Popov A., Salnikov P., Battulin N., Fishman V. Function and evolution of the loop extrusion machinery in animals. Int. J. Mol. Sci. 2023;24(5):5017. DOI 10.3390/ijms24055017

5. Korablev A., Lukyanchikova V., Serova I., Battulin N. On-target CRISPR/Cas9 activity can cause undesigned large deletion in mouse zygotes. Int. J. Mol. Sci. 2020;21(10):3604. DOI 10.3390/ijms21103604

6. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras. Cell Tissue Res. 2008;334(3):371-380. DOI 10.1007/s00441-008-0702-9

7. Li S., Prasanna X., Salo V.T., Vattulainen I., Ikonen E. An efficient auxin-inducible degron system with low basal degradation in human cells. Nat. Methods. 2019;16(9):866-869. DOI 10.1038/s41592-019-0512-x

8. Litwin I., Pilarczyk E., Wysocki R. The emerging role of cohesin in the DNA damage response. Genes (Basel). 2018;9(12):581. DOI 10.3390/genes9120581

9. Losada A., Hirano M., Hirano T. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev. 1998;12(13):1986-1997. DOI 10.1101/gad.12.13.1986

10. Nabet B., Roberts J.M., Buckley D.L., Paulk J., Dastjerdi S., Yang A., Leggett A.L., Erb M.A., Lawlor M.A., Souza A., Scott T.G., Vittori S., Perry J.A., Qi J., Winter G.E., Wong K.-K., Gray N.S., Bradner J.E. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nat. Chem. Biol. 2018;14:431-441. DOI 10.1038/s41589-018-0021-8

11. Nuebler J., Fudenberg G., Imakaev M., Abdennur N., Mirny L.A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018;115(29): E6697-E6706. DOI 10.1073/pnas.1717730115

12. Phanindhar K., Mishra R.K. Auxin-inducible degron system: an efficient protein degradation tool to study protein function. Biotechniques. 2023;74(4):186-198. DOI 10.2144/btn-2022-0108

13. Seitan V.C., Hao B., Tachibana-Konwalski K., Lavagnolli T., MiraBontenbal H., Brown K.E., Teng G., Carroll T., Terry A., Horan K., Marks H., Adams D.J., Schatz D.G., Aragon L., Fisher A.G., Krangel M.S., Nasmyth K., Merkenschlager M. A role for cohesin in T- cell-receptor rearrangement and thymocyte differentiation. Nature. 2011;476(7361):467-471. DOI 10.1038/nature10312

14. Yesbolatova A., Saito Y., Kitamoto N., Makino-Itou H., Ajima R., Nakano R., Nakaoka H., Fukui K., Gamo K., Tominari Y., Takeuchi H., Saga Y., Hayashi K., Kanemaki M.T. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat. Commun. 2020;11(1):5701. DOI 10.1038/s41467-020-19532-z

15. Yu K., Liu C., Kim B.-G., Lee D.-Y. Synthetic fusion protein design and applications. Biotechnol. Adv. 2015;33(1):155-164. DOI 10.1016/j.biotechadv.2014.11.005

16. Yunusova A., Smirnov A., Shnaider T., Lukyanchikova V., Afonnikova S., Battulin N. Evaluation of the OsTIR1 and AtAFB2 AID systems for genome architectural protein degradation in mammalian cells. Front. Mol. Biosci. 2021;8:757394. DOI 10.3389/fmolb.2021.757394

17. Zhang M., Zhao Y., Liu X., Ruan X., Wang P., Liu L., Wang D., Dong W., Yang C., Xue Y. Pseudogene MAPK6P4-encoded functional peptide promotes glioblastoma vasculogenic mimicry develop ment. Commun. Biol. 2023;6(1):1059. DOI 10.1038/s42003-023-05438-1