Аллель-специфичная ПЦР с флуоресцентно-мечеными зондами: критерии подбора праймеров для генотипирования

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) могут служить надежными маркерами в генной инженерии, селекции, скрининговых обследованиях и других областях науки, медицины и производства. Полногеномное секвенирование и генотипирование при помощи секвенирования могут высокоспецифично детектировать SNP и выявлять новые аллели. Однако в ситуациях, когда интерес исследователей направлен на отдельные конкретные локусы, эти методы становятся избыточными, а их цена, доля ложноположительных и ложноотрицательных результатов и трудозатраты на пробоподготовку и анализ не оправдывают их применения. Поэтому точные и быстрые методы генотипирования отдельных аллелей все еще остаются востребованными, особенно при проверке кандидатных полиморфизмов в анализах ассоциации с определенным фенотипом. Один из таких методов – генотипирование с использованием аллель-специфичных зондов TaqMan (TaqMan dual labeled probes). Метод заключается в реакции ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров и двух олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательности вблизи данного локуса таким образом, что один зонд комплементарен аллелю дикого типа, а другой – мутантному аллелю. Преимущества метода заключаются в его специфичности, чувствительности, невысокой стоимости и быстроте получения результатов. Он позволяет с высокой точностью различать аллели в геноме в одностадийной ПЦР без дополнительного этапа разделения продуктов реакции, что делает его востребованным в исследованиях генетических ассоциаций в молекулярной генетике и медицине. Благодаря развитию технологий синтеза олигонуклеотидов и совершенствованию методов подбора праймеров и зондов можно ожидать расширения возможностей применения этого подхода в диагностике наследственных заболеваний. В настоящей статье мы разобрали основные принципы метода, процессы, влияющие на результат генотипирования, критерии подбора оптимальных праймеров и зондов, использование LNA-модификаций в олигонуклеотидах, а также привели протокол подбора праймеров, зондов и ПЦР на примере SNP rs11121704. Мы надеемся, что представленный протокол позволит исследовательским группам самостоятельно подбирать собственные эффективные тест-системы для проверки интересующих полиморфизмов.

1. Broccanello C., Chiodi C., Funk A., McGrath J.M., Panella L., Stevanato P. Comparison of three PCR­based assays for SNP genotyping in plants. Plant Methods. 2018;14:28. DOI 10.1186/s13007­018­0295­6

2. Debode F., Marien A., Janssen E., Bragard C., Berben G. The influence of amplicon length on real­time PCR results. Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2017;27(1):3­11. DOI 10.25518/1780­4507.13461

3. Huang Q., Li Q. Characterization of the 5ʹ to 3ʹ nuclease activi ty of Thermus aquaticus DNA polymerase on fluorogenic double­stranded probes. Mol. Cell. Probes. 2009;23(3­4):188­194. DOI 10.1016/j.mcp.2009.04.002

4. Hui L., DelMonte T., Ranade K. Genotyping using the TaqMan assay. Curr. Protoc. Hum. Genet. 2008;56(2):2.10.1­2.10.8. DOI 10.1002/0471142905.hg0210s56

5. Kalendar R., Shustov A.V., Akhmetollayev I., Kairov U. Designing allele­specific competitive­extension PCR­based assays for highthroughput genotyping and gene characterization. Front. Mol. Biosci. 2022;9:773956. DOI 10.3389/fmolb.2022.773956

6. Owczarzy R., You Y., Groth C.L., Tataurov A.V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid­DNA duplexes. Biochemistry. 2011;50(43):9352­9367. DOI 10.1021/bi200904e

7. Ranade K., Chang M.S., Ting C.T., Pei D., Hsiao C.F., Olivier M., Pesich R., Hebert J., Chen Y.D., Dzau V.J., Curb D., Olshen R., Risch N., Cox D.R., Botstein D. High­throughput genotyping with single nucleotide polymorphisms. Genome Res. 2001;11(7):1262­1268. DOI 10.1101/gr.157801

8. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006;34(8):e60. DOI 10.1093/nar/gkl175