Получение и характеристика линий эмбриональных стволовых клеток мыши с нокаутом гена Mcph1 (микроцефалин)

Хроматин в ядре клетки распределен не хаотично, а имеет организованную структуру, которая оказывает прямое влияние на функционирование генома. Одними из основных архитектурных белков хроматина в клетках млекопитающих являются консервативные мультисубъединичные белковые комплексы: когезин и конденсины. Эти комплексы способны протягивать петли хроматина, опосредуя контакты между удаленными участками ДНК. Тонкая временная регуляция их активности осуществляется рядом других белков, один из которых – микроцефалин (Mcph1). Mcph1 препятствует взаимодействию конденсина II с хроматином в интерфазе. При нарушении его функции наблюдается масштабная реорганизация хроматина, вызванная аномальной загрузкой конденсина II. Как это сказывается на экспрессии генов, до сих пор неизвестно. В данном исследовании мы создали несколько линий эмбриональных стволовых клеток мыши с нокаутом гена Mcph1, охарактеризовали их и проанализировали профиль экспрессии генов. Аннотация дифференциально экспрессирующихся генов в терминах генной онтологии выявила категории генов, относящиеся к общему метаболизму и функционированию обонятельных рецепторов, но не к регуляции клеточного цикла, описанной ранее для Mcph1. Мы также не обнаружили корреляции между генами, изменившими свою транскрипционную активность после нокаута Mcph1, и вероятностью их локализации на ядерной ламине. Этот результат ставит под сомнение гипотезу о влиянии опосредованной нокаутом Mcph1 архитектуры хроматина на экспрессию генов. Среди негативных эффектов нокаута Mcph1 мы наблюдали множественные хромосомные аберрации, включая нарушения сегрегации хромосом с образованием микроядер, а также слияние хромосом. Это подтверждает описанную в предыдущих исследованиях роль белка Mcph1 в поддержании целостности структуры генома. Мы полагаем, что нокаут Mcph1 может оказаться своеобразным «розеттским камнем», способным расшифровать функции конденсина II в интерфазном ядре. Полученные нами линии эмбриональных стволовых клеток с нокаутом гена Mcph1 могут быть использованы для дальнейшего изучения влияния структурных белков хроматина на экспрессию генов.

1. Abdennur N., Schwarzer W., Pekowska A., Shaltiel I.A., Huber W., Haering C.H., Mirny L., Spitz F. Condensin II inactivation in inter-phase does not affect chromatin folding or gene expression. BioRxiv. 2018;437459. DOI 10.1101/437459

2. Alsolami M., Aboalola D., Malibari D., Alghamdi T., Alshekhi W., Jad H., Rumbold-Hall R., Altowairqi A.S., Bell S.M., Alsiary R.A. The emerging role of MCPH1/BRIT1 in carcinogenesis. Front. Oncol. 2023;13:1047588. DOI 10.3389/fonc.2023.1047588

3. Arroyo M., Kuriyama R., Trimborn M., Keifenheim D., Cañuelo A., Sánchez A., Clarke D.J., Marchal J.A. MCPH1, mutated in primary microcephaly, is required for efficient chromosome alignment during mitosis. Sci. Rep. 2017;7(1):13019. DOI 10.1038/s41598-017-12793-7

4. Borsos M., Perricone S.M., Schauer T., Pontabry J., de Luca K.L., de Vries S.S., Ruiz-Morales E.R., Torres-Padilla M.-E., Kind J. Genome-lamina interactions are established de novo in the early mouse embryo. Nature. 2019;569(7758):729-733. DOI 10.1038/s41586-019-1233-0

5. Brogna S., Wen J. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mechanisms. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009;16(2):107-113. DOI 10.1038/nsmb.1550

6. Cicconi A., Rai R., Xiong X., Broton C., Al-Hiyasat A., Hu C., Dong S., Sun W., Garbarino J., Bindra R.S., Schildkraut C., Chen Y., Chang S. Microcephalin 1/BRIT1-TRF2 interaction promotes telomere replication and repair, linking telomere dysfunction to primary microcephaly. Nat. Commun. 2020;11(1):5861. DOI 10.1038/s41467-020-19674-0

7. Dixon J.R., Selvaraj S., Yue F., Kim A., Li Y., Shen Y., Hu M., Liu J.S., Ren B. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 2012;485(7398):376-380. DOI 10.1038/nature11082

8. Dowen J.M., Bilodeau S., Orlando D.A., Hübner M.R., Abraham B.J., Spector D.L., Young R.A. Multiple structural maintenance of chromosome complexes at transcriptional regulatory elements. Stem Cell Reports. 2013;1(5):371-378. DOI 10.1016/j.stemcr.2013.09.002

9. Earnshaw W.C., Laemmli U.K. Architecture of metaphase chromosomes and chromosome scaffolds. J. Cell Biol. 1983;96(1):84-93. DOI 10.1083/jcb.96.1.84

10. Gibcus J.H., Samejima K., Goloborodko A., Samejima I., Naumova N., Nuebler J., Kanemaki M.T., Xie L., Paulson J.R., Earnshaw W.C., Mirny L.A., Dekker J. A pathway for mitotic chromosome formation. Science. 2018;359(6376):eaao6135. DOI 10.1126/science.aao6135

11. Gruber R., Zhou Z., Sukchev M., Joerss T., Frappart P.-O., Wang Z.-Q. MCPH1 regulates the neuroprogenitor division mode by coupling the centrosomal cycle with mitotic entry through the Chk1–Cdc25 pathway. Nat. Cell Biol. 2011;13(11):1325-1334. DOI 10.1038/ncb2342

12. Hirota T., Gerlich D., Koch B., Ellenberg J., Peters J.-M. Distinct functions of condensin I and II in mitotic chromosome assembly. J. Cell Sci. 2004;117(26):6435-6445. DOI 10.1242/jcs.01604

13. Hoencamp C., Dudchenko O., Elbatsh A.M.O., Brahmachari S., Raaijmakers J.A., van Schaik T., Sedeño Cacciatore Á., Contessoto V.G., van Heesbeen R.G.H.P., van den Broek B., … Medema R.H., van Steensel B., de Wit E., Onuchic J.N., Di Pierro M., Lieberman Aiden E., Rowland B.D. 3D genomics across the tree of life reveals condensin II as a determinant of architecture type. Science. 2021;372(6545):984-989. DOI 10.1126/science.abe2218

14. Houlard M., Cutts E.E., Shamim M.S., Godwin J., Weisz D., Presser Aiden A., Lieberman Aiden E., Schermelleh L., Vannini A., Nasmyth K. MCPH1 inhibits condensin II during interphase by regulating its SMC2-kleisin interface. eLife. 2021;10:e73348. DOI 10.7554/eLife.73348

15. Jackson A.P., Eastwood H., Bell S.M., Adu J., Toomes C., Carr I.M., Roberts E., Hampshire D.J., Crow Y.J., Mighell A.J., Karbani G., Jafri H., Rashid Y., Mueller R.F., Markham A.F., Woods C.G. Identification of microcephalin, a protein implicated in determining the size of the human brain. Am. J. Hum. Genet. 2002;71(1):136-142. DOI 10.1086/341283

16. Journiac N., Gilabert-Juan J., Cipriani S., Benit P., Liu X., Jacquier S., Faivre V., Delahaye-Duriez A., Csaba Z., Hourcade T., Melinte E., Lebon S., Violle-Poirsier C., Oury J.-F., Adle-Biassette H., Wang Z.-Q., Mani S., Rustin P., Gressens P., Nardelli J. Cell metabolic alterations due to Mcph1 mutation in microcephaly. Cell Rep. 2020;31(2):107506. DOI 10.1016/j.celrep.2020.03.070

17. Kristofova M., Ori A., Wang Z.-Q. Multifaceted microcephaly-related gene MCPH1. Cells. 2022;11(2):275. DOI 10.3390/cells11020275

18. Lin S.-Y., Elledge S.J. Multiple tumor suppressor pathways negatively regulate telomerase. Cell. 2003;113(7):881-889. DOI 10.1016/S0092-8674(03)00430-6

19. Liu X., Zhou Z.-W., Wang Z.-Q. The DNA damage response molecule MCPH1 in brain development and beyond. Acta Biochim. Biophys. Sin. 2016;48(7):678-685. DOI 10.1093/abbs/gmw048

20. Marchal C., Sima J., Gilbert D.M. Control of DNA replication timing in the 3D genome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019;20(12):721-737. DOI 10.1038/s41580-019-0162-y

21. Matveeva N.M., Fishman V.S., Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Pristyazhnyuk I.E., Menzorov A.G., Serov O.L. Alternative dominance of the parental genomes in hybrid cells generated through the fusion of mouse embryonic stem cells with fibroblasts. Sci. Rep. 2017;7(1):18094. DOI 10.1038/s41598-017-18352-4

22. Menzorov A.G., Orishchenko K.E., Fishman V.S., Shevtsova A.A., Mungalov R.V., Pristyazhnyuk I.E., Kizilova E.A., Matveeva N.M., Alenina N., Bader M., Rubtsov N.B., Serov O.L. Targeted genomic integration of EGFP under tubulin beta 3 class III promoter and mEos2 under tryptophan hydroxylase 2 promoter does not produce sufficient levels of reporter gene expression. J. Cell. Biochem. 2019; 120(10):17208-17218. DOI 10.1002/jcb.28981

23. Naumova N., Imakaev M., Fudenberg G., Zhan Y., Lajoie B.R., Mirny L.A., Dekker J. Organization of the mitotic chromosome. Science. 2013;342(6161):948-953. DOI 10.1126/science.1236083

24. Neitzel H., Neumann L.M., Schindler D., Wirges A., Tönnies H., Trimborn M., Krebsova A., Richter R., Sperling K. Premature chromosome condensation in humans associated with microcephaly and mental retardation: a novel autosomal recessive condition. Am. J. Hum. Genet. 2002;70(4):1015-1022. DOI 10.1086/339518

25. Ono T., Fang Y., Spector D.L., Hirano T. Spatial and temporal regulation of condensins I and II in mitotic chromosome assembly in human cells. Mol. Biol. Cell. 2004;15(7):3296-3308. DOI 10.1091/mbc.e04-03-0242

26. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat. Methods. 2017;14(4):417-419. DOI 10.1038/nmeth.4197

27. Pulvers J.N., Journiac N., Arai Y., Nardelli J. MCPH1: a window into brain development and evolution. Front. Cell. Neurosci. 2015;9:92. DOI 10.3389/fncel.2015.00092

28. Rao S.S.P., Huntley M.H., Durand N.C., Stamenova E.K., Bochkov I.D., Robinson J.T., Sanborn A.L., Machol I., Omer A.D., Lander E.S., Aiden E.L. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 2014;159(7):1665-1680. DOI 10.1016/j.cell.2014.11.021

29. Sanders J.T., Freeman T.F., Xu Y., Golloshi R., Stallard M.A., Hill A.M., San Martin R., Balajee A.S., McCord R.P. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nat. Com-mun. 2020;11(1):6178. DOI 10.1038/s41467-020-20047-w

30. Shi L., Li M., Su B. MCPH1/BRIT1 represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene. Gene. 2012;495(1):1-9. DOI 10.1016/j.gene.2011.12.053

31. Shi L., Li M., Lin Q., Qi X., Su B. Functional divergence of the brain-size regulating gene MCPH1 during primate evolution and the origin of humans. BMC Biol. 2013;11(1):62. DOI 10.1186/1741-7007-11-62

32. Stadhouders R., Filion G.J., Graf T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 2019;569(7756): 345-354. DOI 10.1038/s41586-019-1182-7

33. Trimborn M., Schindler D., Neitzel H.H.T. Misregulated chromosome condensation in MCPH1 primary microcephaly is mediated by condensin II. Cell Cycle. 2006;5(3):322-326. DOI 10.4161/cc.5.3.2412

34. Wallace H.A., Bosco G. Condensins and 3D organization of the interphase nucleus. Curr. Genet. Med. Rep. 2013;1(4):219-229. DOI 10.1007/s40142-013-0024-4

35. Yamashita D., Shintomi K., Ono T., Gavvovidis I., Schindler D., Neitzel H., Trimborn M., Hirano T. MCPH1 regulates chromosome condensation and shaping as a composite modulator of condensin II. J. Cell Biol. 2011;194(6):841-854. DOI 10.1083/jcb.201106141

36. Yang S., Lin F., Lin W. MCPH1/BRIT1 cooperates with E2F1 in the activation of checkpoint, DNA repair and apoptosis. EMBO Rep. 2008;9(9):907-915. DOI 10.1038/embor.2008.128

37. Yuen K.C., Slaughter B.D., Gerton J.L. Condensin II is anchored by TFIIIC and H3K4me3 in the mammalian genome and supports the expression of active dense gene clusters. Sci. Adv. 2017;3(6): e1700191. DOI 10.1126/sciadv.1700191

38. Yunusova A., Smirnov A., Shnaider T., Lukyanchikova V., Afonnikova S., Battulin N. Evaluation of the OsTIR1 and AtAFB2 AID systems for genome architectural protein degradation in mammalian cells. Front. Mol. Biosci. 2021;8:757394. DOI 10.3389/fmolb.2021.757394