Изучение конкатенации баркодированных трансгенов, линеаризованных Cas9

   При пронуклеарной микроинъекции эндонуклеаза Cas9 используется для создания двуцепочечных разрывов ДНК in vivo в геномном целевом локусе или внутри донорского вектора для улучшения интеграции трансгена. Взаимодействие Cas9 с факторами репарации ДНК во время обработки концов трансгена и интеграции – актуальная тема. Ранее мы разработали генетическую систему на основе баркодов для анализа рекомбинации трансгенов после пронуклеарной микроинъекции у мышей. При этом подходе плазмидная библиотека линеаризуется ферментом рестрикции или комплексом Cas9:gRNA на участке между парой баркодов. Пул баркодированных молекул вводится внутрь пронуклеуса, что приводит к образованию многокопийных конкатемеров. В представленной статье мы сравнили эффекты разрезания Cas9 в условиях in vivo (эксперимент RNP+) или для трансгенов, линеаризованных in vitro и очищенных через агарозный гель (эксперимент RNP–). В эксперименте RNP+ было обнаружено два трансгенных однокопийных эмбриона. В эксперименте RNP– было идентифицировано шесть положительных эмбрионов, четыре из них имели низкокопийные конкатемеры. Анализ баркодов методом NGS показал, что 53 % баркодированных концов поменяли свои исходные пары баркодов, что является признаком гомологичной рекомбинации между концами трансгенов. Из 20 слияний «трансген-трансген» 11 не имели мутаций и, по-видимому, были получены путем повторного лигирования тупых концов, полученных с помощью Cas9. Большинство мутировавших соединений содержало асимметричные делеции 2–4 нуклеотидов из-за специфического тримминга концов Cas9. Эти данные указывают на то, что связанная с Cas9 ДНК создает препятствия для конкатенации. В то же время свободные концы ДНК соединяются таким же образом, как и концы, обработанные рестриктазами, но с характерной асимметрией. Будущие эксперименты с пронуклеарными микроинъекциями CRISPR/Cas помогут понять, как CRISPR-нуклеазы влияют на репарацию ДНК.

1. Abe T., Inoue K., Furuta Y., Kiyonari H. Pronuclear microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Rep. 2020; 31(7):107653. doi: 10.1016/j.celrep.2020.107653

2. Clarke R., Heler R., MacDougall M.S., Yeo N.C., Chavez A., Regan M., Hanakahi L., Church G.M., Marraffini L.A., Merrill B.J. Enhanced bacterial immunity and mammalian genome editing via RNA-polymerase-mediated dislodging of Cas9 from double-strand DNA breaks. Mol Cell. 2018;71(1):42-55.e8. doi: 10.1016/j.molcel.2018.06.005

3. Cock P.J.A., Antao T., Chang J.T., Chapman B.A., Cox C.J., Dalke A., Friedberg I., Hamelryck T., Kauff F., Wilczynski B., De Hoon M.J.L. Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics. 2009;25(11):1422-1423. doi: 10.1093/bioinformatics/btp163

4. Cock P.J.A., Fields C.J., Goto N., Heuer M.L., Rice P.M. The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants. Nucleic Acids Res. 2010;38(6): 1767-1771. doi: 10.1093/nar/gkp1137

5. Dai J., Cui X., Zhu Z., Hu W. Non-homologous end joining plays a key role in transgene concatemer formation in transgenic zebrafish embryos. Int J Biol Sci. 2010;6(7):756-768. doi: 10.7150/ijbs.6.756

6. Danner E., Lebedin M., De La Rosa K., Kühn R. A homology independent sequence replacement strategy in human cells using a CRISPR nuclease. Open Biol. 2021;11(1):200283. doi: 10.1098/rsob.200283

7. Gurtan A.M., Lu V., Bhutkar A., Sharp P.A. In vivo structure-function analysis of human Dicer reveals directional processing of precursor miRNAs. RNA. 2012;18(6):1116-1122. doi: 10.1261/rna.032680.112

8. Harms D.W., Quadros R.M., Seruggia D., Ohtsuka M., Takahashi G., Montoliu L., Gurumurthy C.B. Mouse genome editing using the CRISPR/Cas system. Curr Protoc Hum Genet. 2014;83:15.7.1-15.7.27. doi: 10.1002/0471142905.hg1507s83

9. Jinek M., Jiang F., Taylor D.W., Sternberg S.H., Kaya E., Ma E., Anders C., Hauer M., Zhou K., Lin S., Kaplan M., Iavarone A.T., Charpentier E., Nogales E., Doudna J.A. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 2014;343(6176):1247997. doi: 10.1126/science.1247997

10. Maggio I., Holkers M., Liu J., Janssen J.M., Chen X., Gonçalves M.A.F.V. Adenoviral vector delivery of RNA-guided CRISPR/Cas9 nuclease complexes induces targeted mutagenesis in a diverse array of human cells. Sci Rep. 2014;4(1):5105. doi: 10.1038/srep05105

11. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J., Guell M., DiCarlo J.E., Norville J.E., Church G.M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339(6121):823-826. doi: 10.1126/science.1232033

12. Maltseva E.A., Vasil’eva I.A., Moor N.A., Kim D.V., Dyrkheeva N.S., Kutuzov M.M., Vokhtantsev I.P., Kulishova L.M., Zharkov D.O., Lavrik O.I. Cas9 is mostly orthogonal to human systems of DNA break sensing and repair. PLoS One. 2023;18(11):e0294683. doi: 10.1371/journal.pone.0294683

13. Nishimasu H., Ran F.A., Hsu P.D., Konermann S., Shehata S.I., Dohmae N., Ishitani R., Zhang F., Nureki O. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2014;156(5): 935-949. doi: 10.1016/j.cell.2014.02.001

14. Reginato G., Dello Stritto M.R., Wang Y., Hao J., Pavani R., Schmitz M., Halder S., Morin V., Cannavo E., Ceppi I., Braunshier S., Acharya A., Ropars V., Charbonnier J.-B., Jinek M., Nussenzweig A., Ha T., Cejka P. HLTF disrupts Cas9-DNA post-cleavage complexes to allow DNA break processing. Nat Commun. 2024;15(1):5789. doi: 10.1038/s41467-024-50080-y

15. Richardson C.D., Ray G.J., DeWitt M.A., Curie G.L., Corn J.E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 2016;34(3):339-344. doi: 10.1038/nbt.3481

16. Rohan R.M., King D., Frels W.I. Direct sequencing of PCR-amplified junction fragments from tandemly repeated transgenes. Nucleic Acids Res. 1990;18(20):6089-6095. doi: 10.1093/nar/18.20.6089

17. Sakuma T., Nakade S., Sakane Y., Suzuki K.-I.T., Yamamoto T. MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems. Nat Protoc. 2016;11(1):118-133. doi: 10.1038/nprot.2015.140

18. Schimmel J., Kool H., Van Schendel R., Tijsterman M. Mutational signatures of non‐homologous and polymerase theta‐mediated end-joining in embryonic stem cells. EMBO J. 2017;36(24):3634-3649. doi: 10.15252/embj.201796948

19. Smirnov A., Fishman V., Yunusova A., Korablev A., Serova I., Skryabin B.V., Rozhdestvensky T.S., Battulin N. DNA barcoding reveals that injected transgenes are predominantly processed by homologous recombination in mouse zygote. Nucleic Acids Res. 2020; 48(2):719-735. doi: 10.1093/nar/gkz1085

20. Stephenson A.A., Raper A.T., Suo Z. Bidirectional degradation of DNA cleavage products catalyzed by CRISPR/Cas9. J Am Chem Soc. 2018;140(10):3743-3750. doi: 10.1021/jacs.7b13050

21. Suzuki K., Tsunekawa Y., Hernandez-Benitez R., Wu J., Zhu J., Kim E.J., Hatanaka F., Yamamoto M., Araoka T., Li Z., Kurita M., Hishida T., Li M., Aizawa E., Guo S., Chen S., Goebl A., Soligalla R.D., Qu J., Jiang T., Fu X., Jafari M., Esteban C.R., Berggren W.T., Lajara J., Nuñez-Delicado E., Guillen P., Campistol J.M., Matsuzaki F., Liu G.-H., Magistretti P., Zhang K., Callaway E.M., Zhang K., Belmonte J.C.I. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 2016; 540(7631):144-149. doi: 10.1038/nature20565

22. Taheri-Ghahfarokhi A., Taylor B.J.M., Nitsch R., Lundin A., Cavallo A.-L., Madeyski-Bengtson K., Karlsson F., Clausen M., Hicks R., Mayr L.M., Bohlooly-Y.M., Maresca M. Decoding non-random mutational signatures at Cas9 targeted sites. Nucleic Acids Res. 2018; 46(16):8417-8434. doi: 10.1093/nar/gky653

23. Takeo T., Nakagata N. Combination medium of cryoprotective agents containing l-glutamine and methyl-β-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab Anim. 2010;44(2):132-137. doi: 10.1258/la.2009.009074

24. Takeo T., Nakagata N. Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed C57BL/6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod. 2011;85(5):1066-1072. doi: 10.1095/biolreprod.111.092536

25. Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura K., Irie T., Nakagata N. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol efflux from the cells. Biol Reprod. 2008;78(3): 546-551. doi: 10.1095/biolreprod.107.065359