Транскриптомный анализ признака симбиотической отзывчивости у гороха посевного (Pisum sativum L.)

Горох посевной (Pisum sativum L.) является важной сельскохозяйственной культурой и модельным объектом для изучения молекулярно-генетических основ азотфиксирующего симбиоза и арбускулярной микоризы (АМ). Описаны генотипы гороха с высокой и низкой отзывчивостью на инокуляцию клубеньковыми бактериями (ризобиями) и АМ грибами: «отзывчивые» генотипы демонстрируют прибавку массы семян при инокуляции, а для «неотзывчивых» генотипов такая реакция не характерна. С целью описания молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе симбиотической отзывчивости, был проведен транскриптомный анализ целых корневых систем растений гороха «отзывчивого» генотипа к-8274 (сорт Vendevil, Франция) и «неотзывчивого» генотипа к-3358 (сорт из Саратовской области, Россия), выращенных в почве без инокуляции (контроль) и при инокуляции ризобиями (одиночная инокуляция) и ризобиями совместно с АМ грибами (двойная инокуляция). «Отзывчивый» генотип действительно продемонстрировал выраженный ответ на уровне транскриптома на одиночную и двойную инокуляцию, в отличие от «неотзывчивого» генотипа. Одиночная инокуляция привела у к-8274 к специфическому повышению экспрессии генов, связанных с катаболизмом полиаминов, метаболизмом липидов и сигналингом на основе жасмоновой и салициловой кислот. При двойной инокуляции у к-8274 была повышена экспрессия генов, связанных с арбускулярно-микоризной инфекцией, и понижена экспрессия генов, связанных с клубенькообразованием. Данный факт соответствует фенотипу растений: число клубеньков у к-8274 было снижено при двойной инокуляции по сравнению с контролем. Таким образом, одним из механизмов, лежащих в основе симбиотической отзывчивости у гороха, может быть строгий контроль над числом клубеньков. Наконец, сравнение экспрессионных профилей корней растений к-8274 и к-3358 в условиях двойной инокуляции позволило идентифицировать «транскриптомные сигнатуры», характерные для симбиотически отзывчивого генотипа к-8274. Дальнейшая работа будет направлена на подтверждение возможности использования выявленных генов в качестве транскриптомных маркеров признака симбиотической отзывчивости у гороха посевного.

1. Afonin A.M., Gribchenko E.S., Zorin E.A., Sulima A.S., Romanyuk D.A., Zhernakov A.I., Shtark O.Y., Akhtemova G.A., Zhukov V.A. Unique transcriptome features of pea (Pisum sativum L.) lines with differing responses to beneficial soil microorganisms. Ecol Genet. 2021;19(2):131-141. doi 10.17816/ECOGEN54703

2. Alexa A., Rahnenfuhrer J. topGO: enrichment analysis for gene ontology. R Package Version 2.58.0. 2024. doi 10.18129/B9.bioc.topGO. https://bioconductor.org/packages/topGO

3. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. 2010. Available at: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc

4. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30(15):2114-2120. doi 10.1093/bioinformatics/btu170

5. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden T. L. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics. 2009;10:421. doi 10.1186/1471-2105-10-421

6. Castillejo M.Á., Bani M., Rubiales D. Understanding pea resistance mechanisms in response to Fusarium oxysporum through proteomic analysis. Phytochemistry. 2015;115(1):44-58. doi 10.1016/j.phytochem.2015.01.009

7. Catford J., Staehelin C., Lerat S., Piché Y., Vierheilig H. Suppression of arbuscular mycorrhizal colonization and nodulation in split‐root systems of alfalfa after pre‐inoculation and treatment with Nod factors. J Exp Bot. 2003;54(386):1481-1487. doi 10.1093/jxb/erg156

8. Cerna H., Černý M., Habánová H., Šafářová D., Abushamsiya K., Navrátil M., Brzobohatý B. Proteomics offers insight to the mechanism behind Pisum sativum L. response to pea seed-borne mosaic virus (PSbMV). J Proteomics. 2017;153:78-88. doi 10.1016/j.jprot.2016.05.018

9. Chen H., Boutros P.C. VennDiagram: a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R. BMC Bioinformatics. 2011;12:35. doi 10.1186/1471-2105-12-35

10. Danecek P., Bonfield J.K., Liddle J., Marshall J., Ohan V., Pollard M.O., Whitwham A., Keane T., McCarthy S.A., Davies R.M. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience. 2021;10(2):giab008. doi 10.1093/gigascience/giab008

11. Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F., Drenkow J., Zaleski C., Jha S., Batut P., Chaisson M., Gingeras T.R. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29(1):15-21. doi 10.1093/bioinformatics/bts635

12. Ewels P., Magnusson M., Lundin S., Käller M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 2016;32(19):3047-3048. doi 10.1093/bioinformatics/btw354

13. Ferguson B.J., Mens C., Hastwell A.H., Zhang M., Su H., Jones C.H., Chu X., Gresshoff P.M. Legume nodulation: the host controls the party. Plant Cell Environ. 2019;42(1):41-51. doi 10.1111/pce.13348

14. Firmin J.L., Wilson K.E., Carlson R.W., Davies A.E., Downie J.A. Resistance to nodulation of cv. Afghanistan peas is overcome by nodX, which mediates an O‐acetylation of the Rhizobium leguminosarum lipo‐oligosaccharide nodulation factor. Mol Microbiol. 1993; 10(2):351-360. doi 10.1111/j.1365-2958.1993.tb01961.x

15. Fonseca-García C., López-García C.M., Pacheco R., Armada E., Nava N., Pérez-Aguilar R., Solis-Miranda J., Quinto C. Metallothionein1A regulates rhizobial infection and nodulation in Phaseolus vulgaris. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1491. doi 10.3390/ijms23031491

16. Gautrat P., Mortier V., Laffont C., De Keyser A., Fromentin J., Frugier F., Goormachtig S. Unraveling new molecular players involved in the autoregulation of nodulation in Medicago truncatula. J Exp Bot. 2019;70(4):1407-1417. doi 10.1093/jxb/ery465

17. Goyal R.K., Mattoo A.K., Schmidt M.A. Rhizobial–host interactions and symbiotic nitrogen fixation in legume crops toward agriculture sustainability. Front Microbiol. 2021;12:669404. doi 10.3389/fmicb. 2021.669404

18. Harrison M.J. Cellular programs for arbuscular mycorrhizal symbiosis. Curr Opin Plant Biol. 2012;15(6):691-698. doi 10.1016/j.pbi.2012.08.010

19. Jeyasri R., Muthuramalingam P., Karthick K., Shin H., Choi S.H., Ramesh M. Methyl jasmonate and salicylic acid as powerful elicitors for enhancing the production of secondary metabolites in medicinal plants: an updated review. Plant Cell Tissue Organ Cult. 2023; 153(3):447-458. doi 10.1007/s11240-023-02485-8

20. Kälin C., Piombo E., Bourras S., Brantestam A.K., Dubey M., Elfstrand M., Karlsson M. Transcriptomic analysis identifies candidate genes for Aphanomyces root rot disease resistance in pea. BMC Plant Biol. 2024;24(1):144. doi 10.1186/s12870-024-04817-y

21. Kolde R. Package ‘pheatmap.’ R Package. 2015;1(7):790 Kotera Y., Komori H., Tasaki K., Takagi K., Imano S., Katou S. The peroxisomal β-oxidative pathway and benzyl alcohol O-benzoyltransferase HSR201 cooperatively contribute to the biosynthesis of salicylic acid. Plant Cell Physiol. 2023;64(7):758-770. doi 10.1093/pcp/pcad034

22. Lackman P., González-Guzmán M., Tilleman S., Carqueijeiro I., Pérez A.C., Moses T., Seo M., Kanno Y., Häkkinen S.T., Van Montagu M.C.E. Jasmonate signaling involves the abscisic acid receptor PYL4 to regulate metabolic reprogramming in Arabidopsis and tobacco. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(14):5891-5896. doi 10.1073/pnas.1103010108

23. Liao Y., Smyth G.K., Shi W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 2014;30(7):923-930. doi 10.1093/bioinformatics/btt656

24. Lie T.A. Host genes in Pisum sativum L. conferring resistance to European Rhizobium leguminosarum strains. Plant Soil. 1984;82(3): 415-425. doi 10.1007/BF02184279

25. Liu C., Han X., Steenwyk J.L., Shen X.-X. Temporal transcriptomics provides insights into host-pathogen interactions: a case study of Didymella pinodella and disease-resistant and disease-susceptible pea varieties. Crop Health. 2023;1(1):5. doi 10.1007/s44297-023-00005-w

26. Love M.I., Huber W., Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014; 15(12):550. doi 10.1186/s13059-014-0550-8

27. Mamontova T., Afonin A.M., Ihling C., Soboleva A., Lukasheva E., Sulima A.S., Shtark O.Y., Akhtemova G.A., Povydysh M.N., Sinz A., Frolov A., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A. Profiling of seed proteome in pea (Pisum sativum L.) lines characterized with high and low responsivity to combined inoculation with nodule bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi. Molecules. 2019;24(8):1603. doi 10.3390/molecules24081603

28. Martin D.N., Proebsting W.M., Hedden P. Mendel’s dwarfing gene: cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(16):8907-8911. doi 10.1073/pnas.94.16.8907

29. Mohanty S.K., Arthikala M.-K., Nanjareddy K., Lara M. Plant-symbiont interactions: the functional role of expansins. Symbiosis. 2018; 74:1-10. doi 10.1007/s13199-017-0501-8

30. Monte I. Jasmonates and salicylic acid: evolution of defense hormones in land plants. Curr Opin Plant Biol. 2023;76:102470. doi 10.1016/j.pbi.2023.102470

31. Müller L.M., Harrison M.J. Phytohormones, miRNAs, and peptide signals integrate plant phosphorus status with arbuscular mycorrhizal symbiosis. Curr Opin Plant Biol. 2019;50:132-139. doi 10.1016/j.pbi.2019.05.004

32. Okamoto S., Tabata R., Matsubayashi Y. Long-distance peptide signaling essential for nutrient homeostasis in plants. Curr Opin Plant Biol. 2016;34:35-40. doi 10.1016/j.pbi.2016.07.009

33. Oldroyd G.E.D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nat Rev Microbiol. 2013;11(4):252-263. doi 10.1038/nrmicro2990

34. Parihar A.K., Kumar J., Gupta D.S., Lamichaney A., Naik S.J.S., Singh A.K., Dixit G.P., Gupta S., Toklu F. Genomics enabled breeding strategies for major biotic stresses in pea (Pisum sativum L.). Front Plant Sci. 2022;13:861191. doi 10.3389/fpls.2022.861191

35. Parniske M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nat Rev Microbiol. 2008;6(10):763-775. doi 10.1038/nrmicro1987

36. Pii Y., Astegno A., Peroni E., Zaccardelli M., Pandolfini T., Crimi M. The Medicago truncatula N5 gene encoding a root-specific lipid transfer protein is required for the symbiotic interaction with Sinorhizobium meliloti. Mol Plant Microbe Interact. 2009;22(12): 1577-1587. doi 10.1094/MPMI-22-12-1577

37. Reid D.E., Ferguson B.J., Hayashi S., Lin Y.H., Gresshoff P.M. Molecular mechanisms controlling legume autoregulation of nodulation. Ann Botany. 2011;108(5):789-795. doi 10.1093/aob/mcr205

38. Roy S., Liu W., Nandety R.S., Crook A., Mysore K.S., Pislariu C.I., Frugoli J., Dickstein R., Udvardi M.K. Celebrating 20 years of genetic discoveries in legume nodulation and symbiotic nitrogen fixation. Plant Cell. 2020;32(1):15-41. doi 10.1105/tpc19.00279

39. Rubiales D., Barilli E., Rispail N. Breeding for biotic stress resistance in pea. Agriculture. 2023;13(9):1825. doi 10.3390/agriculture13091825

40. Rubiales D., Mikic A. Introduction: legumes in sustainable agriculture. Crit Rev Plant Sci. 2015;34(1-3):2-3. doi 10.1080/07352689.2014.897896

41. Shtark O.Y., Danilova T.N., Naumkina T.S., Vasilchikov A.G., Chebotar V.K., Kazakov A.E., Zhernakov A.I., Nemankin T.A., Prilepskaya N.A., Borisov A.U. Analysis of pea (Pisum sativum L.) source material for breeding of cultivars with high symbiotic potential and choice of criteria for its evaluation. Ecol Genet. 2006;4(2):22-28. doi 10.17816/ecogen4222-28

42. Shtark O.Y., Borisov A.Y., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A. Mutually beneficial legume symbioses with soil microbes and their potential for plant production. Symbiosis. 2012;58(1-3):51-62. doi 10.1007/s13199-013-0226-2

43. Shtark O.Y., Zhukov V.A., Sulima A.S., Singh R., Naumkina T.S., Borisov A.Y. Prospects for the use of multi-component symbiotic systems of the Legumes. Ecol Genet. 2015;13(1):33-46. doi 10.17816/ecogen13133-46

44. Shtark O.Y., Puzanskiy R.K., Avdeeva G.S., Yurkov A.P., Smolikova G.N., Yemelyanov V.V., Kliukova M.S., Shavarda A.L., Kirpichnikova A.A., Zhernakov A.I. Metabolic alterations in pea leaves during arbuscular mycorrhiza development. PeerJ. 2019;7:e7495. doi 10.7717/peerj.7495

45. Smith S.E., Read D. The symbionts forming arbuscular mycorrhizas. In: Smith S.E., Read D. Mycorrhizal Symbiosis. Academic Press, 2008;13-41. doi 10.1016/b978-012370526-6.50003-9

46. Sulima A.S., Zhukov V.A., Afonin A.A., Zhernakov A.I., Tikhonovich I.A., Lutova L.A. Selection signatures in the first exon of paralogous receptor kinase genes from the Sym2 region of the Pisum sativum L. genome. Front Plant Sci. 2017;8:1957. doi 10.3389/fpls.2017.01957

47. Sulima A.S., Zhukov V.A., Kulaeva O.A., Vasileva E.N., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. New sources of Sym2A allele in the pea (Pisum sativum L.) carry the unique variant of candidate LysM-RLK gene LykX. PeerJ. 2019;7:e8070. doi 10.7717/peerj.8070

48. Tsyganov V.E., Tsyganova A.V. Symbiotic regulatory genes controlling nodule development in Pisum sativum L. Plants. 2020;9(12):1741. doi 10.3390/plants9121741

49. Wang D., Dong W., Murray J., Wang E. Innovation and appropriation in mycorrhizal and rhizobial Symbioses. Plant Cell. 2022;34(5): 1573-1599. doi 10.1093/plcell/koac039

50. Wang L., Sun Z., Su C., Wang Y., Yan Q., Chen J., Ott T., Li X. A GmNINa-miR172c-NNC1 regulatory network coordinates the nodulation and autoregulation of nodulation pathways in soybean. Mol Plant. 2019;12(9):1211-1226. doi 10.1016/j.molp.2019.06.002

51. Wickham H. Getting Started with ggplot2. In: ggplot2. Use R! Springer, 2016;11-31. doi 10.1007/978-3-319-24277-4_2

52. Yang J., Lan L., Jin Y., Yu N., Wang D., Wang E. Mechanisms underlying legume–rhizobium symbioses. J Int Plant Biol. 2022;64(2): 244-267. doi 10.1111/jipb.13207

53. Zhukov V.A., Akhtemova G.A., Zhernakov A.I., Sulima A.S., Shtark O.Y., Tikhonovich I.A. Evaluation of the symbiotic effectiveness of pea (Pisum sativum L.) genotypes in pot experiment. Agric Biol. 2017;52(3):607-614. doi 10.15389/agrobiology.2017.3.607eng

54. Zhukov V.A., Zhernakov A.I., Sulima A.S., Kulaeva O.A., Kliukova M.S., Afonin A.M., Shtark O.Y., Tikhonovich I.A. Association study of symbiotic genes in pea (Pisum sativum L.) cultivars grown in symbiotic conditions. Agronomy. 2021a;11(11):2368. doi 10.3390/agronomy11112368

55. Zhukov V., Zorin E., Zhernakov A., Afonin A., Akhtemova G., Bovin A., Dolgikh A., Gorshkov A., Gribchenko E., Ivanova K., Kirienko A., Kitaeva A., Kliukova M., Kulaeva O., Kusakin P., Leppyanen I., Pavlova O., Romanyuk D., Rudaya E., Serova T., Shtark O., Sulima A., Tsyganova A., Vasileva E., Dolgikh E., Tsyganov V., Tikhonovich I. Transcriptomic analysis of sym28 and sym29 supernodulating mutants of pea (Pisum sativum L.) under complex inoculation with beneficial microorganisms. Biol Commun. 2021b; 66(3):181-197. doi 10.21638/spbu03.2021.301

56. Zorin E.A., Kliukova M.S., AfoninA.M., Gribchenko E.S., Gordon M.L., Sulima A.S., Zhernakov A.I., Kulaeva O.A., Romanyuk D.A., Kusakin P.G., Tsyganova A.V., Tsyganov V.E., Tikhonovich I.A., Zhukov V.A. A variable gene family encoding nodule-specific cysteinerich peptides in pea (Pisum sativum L.). Front Plant Sci. 2022;13: 884726. doi 10.3389/fpls.2022.884726

57. Zorin E.A., Sulima A.S., Zhernakov A.I., Kuzmina D.O., Rakova V.A., Kliukova M.S., Romanyuk D.A., Kulaeva O.A., Akhtemova G.A., Shtark O.Y., Tikhonovich I.A., Zhukov V.A. Genomic and transcriptomic analysis of pea (Pisum sativum L.) breeding line ‘Triumph’ with high symbiotic responsivity. Plants. 2023;13(1):78. doi 10.3390/plants13010078