Влияние мутаций гена Non3 на организацию хроматина у Drosophila melanogaster

Ядрышко – это крупная безмембранная субъядерная структура, где происходит биогенез рибосом. Однако известно все больше данных о том, что ядрышко выполняет и другие функции в клетке. Помимо того, что в ядрышке происходят активный синтез и процессинг рРНК, оно является компартментом, на периферии которого локализованы репрессированные участки генома. Таким образом, наряду с ядерной ламиной ядрышко выступает центром организации гетерохроматина. Исследования на клетках человека и дрозофилы показали, что снижение количества отдельных ядрышковых белков приводит к изменениям в морфологии ядрышка, организации гетерохроматина и декластеризации центромер. Данная работа посвящена изучению влияния мутаций в гене Novel nucleolar protein 3 (Non3) D. melanogaster на организацию хроматина в ядре. Ранее было показано, что делеция части гена Non3 приводит к эмбриональной летальности, а снижение количества белка NON3 – к замедлению онтогенеза и формированию Minute-подобного фенотипа у взрослых мух. В настоящей работе мы продемонстрировали, что мутации в гене Non3 супрессируют эффект положения мозаичного типа и увеличивают частоту мейотической рекомбинации. Общее количество классических маркеров гетерохроматина, белка HP1 и модификации гистона H3K9me2, в мозгах и слюнных железах личинок мутантов Non3 существенно не отличается от контроля, согласно оценке вестернблот анализом. Иммуноокрашивание антителами к HP1 и H3K9me2 также не выявило значительного изменения в количестве и паттерне локализации этих белков в прицентромерных районах политенных хромосом слюнных желез. Изучив локализацию белка HP1 у мутантов по гену Non3 с помощью метода DamID (DNA adenine methyltransferase identification), мы также не обнаружили значимых отличий в распределении белка по сравнению с контролем. В гемоцитах мутантов Non3 мы наблюдали изменение морфологии ядрышка и размера области, выявляемой антицентромерными антителами, но это не сопровождалось декластеризацией центромер и отхождением их от периферии ядрышка. Таким образом, белок NON3 важен для формирования/функционирования ядрышка и необходим для правильной упаковки хроматина, однако точный механизм участия NON3 в данных процессах требует дальнейшего изучения.

1. Allshire R.C., Madhani H.D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(4):229-244. doi 10.1038/nrm.2017.119

2. Anders S., Pyl P.T., Huber W. HTSeq – a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 2015;31(2):166169. doi 10.1093/bioinformatics/btu638

3. Andreyeva E.N., Bernardo T.J., Kolesnikova T.D., Lu X., Yarinich L.A., Bartholdy B.A., Guo X., Posukh O.V., Healton S., Willcockson M.A., Pindyurin A.V., Zhimulev I.F., Skoultchi A.I., Fyodorov D.V. Regulatory functions and chromatin loading dynamics of linker histone H1 during endoreplication in Drosophila. Genes Dev. 2017;31(6):603-616. doi 10.1101/gad.295717.116

4. Andreyeva E.N., Ogienko A.A., Yushkova A.A., Popova J.V., Pavlova G.A., Kozhevnikova E.N., Ivankin A.V., Gatti M., Pindyurin A.V. Non3 is an essential Drosophila gene required for proper nucleolus assembly. Vavilov J Genet Breed. 2019;23(2):190-198. doi 10.18699/VJ19.481

5. Baker W.K. Crossing over in heterochromatin. Am Nat. 1958;92(862): 59-60. doi 10.1086/282010

6. Becker J.S., McCarthy R.L., Sidoli S., Donahue G., Kaeding K.E., He Z., Lin S., Garcia B.A., Zaret K.S. Genomic and proteomic resolution of heterochromatin and its restriction of alternate fate genes. Mol Cell. 2017;68(6):1023-1037.e1015. doi 10.1016/j.molcel.2017.11.030

7. Bersaglieri C., Santoro R. Genome organization in and around the nucleolus. Cells. 2019;8(6):579. doi 10.3390/cells8060579

8. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., Karch F., Basler K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific φC31 integrases. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(9):3312-3317. doi 10.1073/pnas.0611511104

9. Biyasheva A., Do T.V., Lu Y., Vaskova M., Andres A.J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Dev Biol. 2001;231(1):234-251. doi 10.1006/dbio.2000.0126

10. Bizhanova A., Kaufman P.D. Close to the edge: heterochromatin at the nucleolar and nuclear peripheries. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2021;1864(1):194666. doi 10.1016/j.bbagrm.2020.194666

11. Bloom K.S. Centromeric heterochromatin: the primordial segregation machine. Annu Rev Genet. 2014;48:457-484. doi 10.1146/annurevgenet-120213-092033

12. Boisvert F.M., van Koningsbruggen S., Navascués J., Lamond A.I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(7):574-585. doi 10.1038/nrm2184

13. Boulon S., Westman B.J., Hutten S., Boisvert F.M., Lamond A.I. The nucleolus under stress. Mol Cell. 2010;40(2):216-227. doi 10.1016/j.molcel.2010.09.024

14. Chang C.H., Chavan A., Palladino J., Wei X., Martins N.M.C., Santinello B., Chen C.C., Erceg J., Beliveau B.J., Wu C.T., Larracuente A.M., Mellone B.G. Islands of retroelements are major components of Drosophila centromeres. PLoS Biol. 2019;17(5):e3000241. doi 10.1371/journal.pbio.3000241

15. Choi I., Jeon Y., Yoo Y., Cho H.S., Pai H.S. The in vivo functions of ARPF2 and ARRS1 in ribosomal RNA processing and ribosome biogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 2020;71(9):2596-2611. doi 10.1093/jxb/eraa019

16. Connolly K., Burnet B., Sewell D. Selective mating and eye pigmentation: an analysis of the visual component in the courtship behavior of Drosophila melanogaster. Evolution. 1969;23(4):548-559. doi 10.1111/j.1558-5646.1969.tb03540.x

17. Cooper K.W. Cytogenetic analysis of major heterochromatic elements (especially Xh and Y) in Drosophila melanogaster, and the theory of “heterochromatin”. Chromosoma. 1959;10:535-588. doi 10.1007/BF00396588

18. Czermin B., Schotta G., Hülsmann B.B., Brehm A., Becker P.B., Reuter G., Imhof A. Physical and functional association of SU(VAR)3-9 and HDAC1 in Drosophila. EMBO Rep. 2001;2(10):915-9. doi 10.1093/embo-reports/kve210

19. Dick C., Johns E.W. The effect of two acetic acid containing fixatives on the histone content of calf thymus deoxyribonucleoprotein and calf thymus tissue. Exp Cell Res. 1968;51(2-3):626-632. doi 10.1016/0014-4827(68)90150-x

20. Eisenhaber F., Wechselberger C., Kreil G. The Brix domain protein family – a key to the ribosomal biogenesis pathway? Trends Biochem Sci. 2001;26(6):345-347. doi 10.1016/s0968-0004(01)01851-5

21. Eissenberg J.C., Morris G.D., Reuter G., Hartnett T. The heterochromatin-associated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. Genetics. 1992;131(2):345-352. doi 10.1093/genetics/131.2.345

22. Elgin S.C., Reuter G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(8):a017780. doi 10.1101/cshperspect.a017780

23. Garzino V., Pereira A., Laurenti P., Graba Y., Levis R.W., Le Parco Y., Pradel J. Cell lineage-specific expression of modulo, a dose-dependent modifier of variegation in Drosophila. EMBO J. 1992;11(12): 4471-4479. doi 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05548.x

24. Gramates L.S., Marygold S.J., Santos G.D., Urbano J.M., Antonazzo G., Matthews B.B., Rey A.J., Tabone C.J., Crosby M.A., Emmert D.B., Falls K., Goodman J.L., Hu Y., Ponting L., Schroeder A.J., Strelets V.B., Thurmond J., Zhou P.; the FlyBase Consortium. FlyBase at 25: looking to the future. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D663D671. doi 10.1093/nar/gkw1016

25. Grewal S.I., Jia S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 2007; 8(1):35-46. doi 10.1038/nrg2008

26. Henikoff S., Ahmad K., Malik H.S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA. Science. 2001;293(5532): 1098-1102. doi 10.1126/science.1062939

27. Hernandez-Verdun D., Roussel P., Thiry M., Sirri V., Lafontaine D.L. The nucleolus: structure/function relationship in RNA metabolism. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2010;1(3):415-431. doi 10.1002/wrna.39

28. Heun P., Erhardt S., Blower M.D., Weiss S., Skora A.D., Karpen G.H. Mislocalization of the Drosophila centromere-specific histone CID promotes formation of functional ectopic kinetochores. Dev Cell. 2006;10(3):303-315. doi 10.1016/j.devcel.2006.01.014

29. Hirano Y., Ishii K., Kumeta M., Furukawa K., Takeyasu K., Horigome T. Proteomic and targeted analytical identification of BXDC1 and EBNA1BP2 as dynamic scaffold proteins in the nucleolus. Genes Cells. 2009;14(2):155-166. doi 10.1111/j.1365-2443.2008.01262.x

30. Hoskins R.A., Carlson J.W., Wan K.H., Park S., Mendez I., Galle S.E., Booth B.W., Pfeiffer B.D., George R.A., Svirskas R., Krzywinski M., Schein J., Accardo M.C., Damia E., Messina G., Méndez-Lago M., de Pablos B., Demakova O.V., Andreyeva E.N., Boldyreva L.V., Marra M., Carvalho A.B., Dimitri P., Villasante A., Zhimulev I.F., Rubin G.M., Karpen G.H., Celniker S.E. The Release 6 reference sequence of the Drosophila melanogaster genome. Genome Res. 2015;25(3):445-458. doi 10.1101/gr.185579.114

31. Iarovaia O.V., Minina E.P., Sheval E.V., Onichtchouk D., Dokudovskaya S., Razin S.V., Vassetzky Y.S. Nucleolus: a central hub for nuclear functions. Trends Cell Biol. 2019;29(8):647-659. doi 10.1016/j.tcb.2019.04.003

32. Janssen A., Colmenares S.U., Karpen G.H. Heterochromatin: guardian of the genome. Annu Rev Cell Dev Biol. 2018;34:265-288. doi 10.1146/annurev-cellbio-100617-062653

33. Johansen K.M., Cai W., Deng H., Bao X., Zhang W., Girton J., Johansen J. Polytene chromosome squash methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila using antibodies. Methods. 2009;48(4):387-397. doi 10.1016/j.ymeth.2009.02.019

34. Kapoor S., Zhu L., Froyd C., Liu T., Rusche L.N. Regional centromeres in the yeast Candida lusitaniae lack pericentromeric heterochromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(39):12139-12144. doi 10.1073/pnas.1508749112

35. Kyriacou E., Heun P. Centromere structure and function: lessons from Drosophila. Genetics. 2023;225(4):iyad170. doi 10.1093/genetics/iyad170

36. Langmead B., Trapnell C., Pop M., Salzberg S.L. Ultrafast and memoryefficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009;10(3):R25. doi 10.1186/gb-2009-10-3-r25

37. Lindsley D.L., Zimm G.G. The Genome of Drosophila melanogaster. New York: Academic Press, 1992

38. Lu B.Y., Emtage P.C., Duyf B.J., Hilliker A.J., Eissenberg J.C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics. 2000;155(2):699-708. doi 10.1093/genetics/155.2.699

39. Maekawa S., Ueda Y., Yanagisawa S. Overexpression of a Brix domain-containing ribosome biogenesis factor ARPF2 and its interactor ARRS1 causes morphological changes and lifespan extension in Arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 2018;9:1177. doi 10.3389/fpls.2018.01177

40. Markstein M., Pitsouli C., Villalta C., Celniker S.E., Perrimon N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 2008;40(4):476483. doi 10.1038/ng.101

41. McPherson W.K., Van Gorder E.E., Hilovsky D.L., Jamali L.A., Keliinui C.N., Suzawa M., Bland M.L. Synchronizing Drosophila larvae with the salivary gland reporter Sgs3-GFP for discovery of phenotypes in the late third instar stage. Dev Biol. 2024;512:35-43. doi 10.1016/j.ydbio.2024.05.002 Meyer-Nava S., Nieto-Caballero V.E., Zurita M., Valadez-Graham V. Insights into HP1a-chromatin interactions. Cells. 2020;9(8):1866. doi 10.3390/cells9081866

42. Meyer-Nava S., Zurita M., Valadez-Graham V. Immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in Drosophila salivary glands. J Vis Exp. 2021;174:e62408. doi 10.3791/62408

43. Morita D., Miyoshi K., Matsui Y., Toh-e A., Shinkawa H., Miyakawa T., Mizuta K. Rpf2p, an evolutionarily conserved protein, interacts with ribosomal protein L11 and is essential for the processing of 27 SB pre-rRNA to 25 S rRNA and the 60 S ribosomal subunit assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 2002;277(32):2878028786. doi 10.1074/jbc.M203399200

44. Németh A., Längst G. Genome organization in and around the nucleolus. Trends Genet. 2011;27(4):149-156. doi 10.1016/j.tig.2011.01.002

45. Olausson H.K., Nistér M., Lindström M.S. Loss of nucleolar histone chaperone NPM1 triggers rearrangement of heterochromatin and synergizes with a deficiency in DNA methyltransferase DNMT3A to drive ribosomal DNA transcription. J Biol Chem. 2014;289(50): 34601-34619. doi 10.1074/jbc.M114.569244

46. Padeken J., Heun P. Centromeres in nuclear architecture. Cell Cycle. 2013;12(22):3455-3456. doi 10.4161/cc.26697

47. Padeken J., Mendiburo M.J., Chlamydas S., Schwarz H.J., Kremmer E., Heun P. The nucleoplasmin homolog NLP mediates centromere clustering and anchoring to the nucleolus. Mol Cell. 2013;50(2): 236-249. doi 10.1016/j.molcel.2013.03.002

48. Panse V.G., Johnson A.W. Maturation of eukaryotic ribosomes: acquisition of functionality. Trends Biochem Sci. 2010;35(5):260-266. doi 10.1016/j.tibs.2010.01.001

49. Pavlakis G.N., Jordan B.R., Wurst R.M., Vournakis J.N. Sequence and secondary structure of Drosophila melanogaster 5.8S and 2S rRNAs and of the processing site between them. Nucleic Acids Res. 1979;7(8):2213-2238. doi 10.1093/nar/7.8.2213

50. Petersen L.K., Stowers R.S. A Gateway MultiSite recombination cloning toolkit. PLoS One. 2011;6(9):e24531. doi 10.1371/journal.pone. 0024531

51. Pindyurin A.V. Genome-wide cell type-specific mapping of in vivo chromatin protein binding using an FLP-inducible DamID system in Drosophila. In: Kaufmann M., Klinger C., Savelsbergh A. (Eds) Functional Genomics. Methods in Molecular Biology. Vol. 1654. New York: Humana Press, 2017;99-124. doi 10.1007/978-1-4939-7231-9_7

52. Pindyurin A.V., Pagie L., Kozhevnikova E.N., van Arensbergen J., van Steensel B. Inducible DamID systems for genomic mapping of Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. chromatin proteins in Drosophila. Nucleic Acids Res. 2016;44(12): 5646-5657. doi 10.1093/nar/gkw176

53. Pindyurin A.V., Ilyin A.A., Ivankin A.V., Tselebrovsky M.V., Nenasheva V.V., Mikhaleva E.A., Pagie L., van Steensel B., Shevelyov Y.Y. The large fraction of heterochromatin in Drosophila neurons is bound by both B-type lamin and HP1a. Epigenetics Chromatin. 2018;11(1):65. doi 10.1186/s13072-018-0235-8

54. Quinodoz S.A., Ollikainen N., Tabak B., Palla A., Schmidt J.M., Detmar E., Lai M.M., Shishkin A.A., Bhat P., Takei Y., Trinh V., Aznauryan E., Russell P., Cheng C., Jovanovic M., Chow A., Cai L., McDonel P., Garber M., Guttman M. Higher-order inter-chromosomal hubs shape 3D genome organization in the nucleus. Cell. 2018;174(3):744-757.e724. doi 10.1016/j.cell.2018.05.024

55. Razin S.V., Ulianov S.V. Genome-directed cell nucleus assembly. Biology (Basel). 2022;11(5):708. doi 10.3390/biology11050708

56. Rea S., Eisenhaber F., O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., Jenuwein T. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyl transferases. Nature. 2000;406(6796):593-599. doi 10.1038/35020506

57. Rodrigues A., MacQuarrie K.L., Freeman E., Lin A., Willis A.B., Xu Z., Alvarez A.A., Ma Y., White B.E.P., Foltz D.R., Huang S. Nucleoli and the nucleoli-centromere association are dynamic during normal development and in cancer. Mol Biol Cell. 2023;34(4):br5. doi 10.1091/mbc.E22-06-0237

58. Schotta G., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T., Dorn R., Reuter G. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. EMBO J. 2002;21(5):1121-1131. doi 10.1093/emboj/21.5.1121

59. Schotta G., Ebert A., Reuter G. SU(VAR)3-9 is a conserved key function in heterochromatic gene silencing. Genetica. 2003;117(2-3): 149-158. doi 10.1023/a:1022923508198

60. Sentmanat M.F., Elgin S.C. Ectopic assembly of heterochromatin in Drosophila melanogaster triggered by transposable elements. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109(35):14104-14109. doi 10.1073/pnas.1207036109

61. Smirnov E., Cmarko D., Mazel T., Hornáček M., Raška I. Nucleolar DNA: the host and the guests. Histochem Cell Biol. 2016;145(4): 359-372. doi 10.1007/s00418-016-1407-x

62. Smith C.D., Shu S., Mungall C.J., Karpen G.H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 2007; 316(5831):1586-1591. doi 10.1126/science.1139815

63. Suárez Freire S., Perez-Pandolfo S., Fresco S.M., Valinoti J., Sorianello E., Wappner P., Melani M. The exocyst complex controls multiple events in the pathway of regulated exocytosis. eLife. 2024;12: RP92404. doi 10.7554/eLife.92404

64. Tavares A.A., Glover D.M., Sunkel C.E. The conserved mitotic kinase polo is regulated by phosphorylation and has preferred microtubuleassociated substrates in Drosophila embryo extracts. EMBO J. 1996; 15(18):4873-4883. doi 10.1002/j.1460-2075.1996.tb00868.x

65. Tracy C., Krämer H. Isolation and infection of Drosophila primary hemocytes. Bio Protoc. 2017;7(11):e2300. doi 10.21769/BioProtoc.2300

66. Trinkle-Mulcahy L. Nucleolus: the consummate nuclear body. In: Lavelle C., Victor J.-M. (Eds) Nuclear Architecture and Dynamics. Academic Press, 2018;257-282. doi 10.1016/B978-0-12-803480-4.00011-9

67. Ugrinova I., Monier K., Ivaldi C., Thiry M., Storck S., Mongelard F., Bouvet P. Inactivation of nucleolin leads to nucleolar disruption, cell cycle arrest and defects in centrosome duplication. BMC Mol Biol. 2007;8:66. doi 10.1186/1471-2199-8-66

68. Westphal T., Reuter G. Recombinogenic effects of suppressors of position-effect variegation in Drosophila. Genetics. 2002;160(2):609621. doi 10.1093/genetics/160.2.609