Концепция природной реконструкции генома. Часть 3. Анализ изменения количества теломерной ДНК в клетках колоний как нового амплифицированного признака, возникшего при обработке гемопоэтических стволовых клеток костного мозга

Индуцированная «реком6иногенная ситуация» в гемопоэтических стволовых клетках и активация репаративных систем клетки создают основу для реком6инационных со6ытий между доставленными в клетку фрагментами экстраклеточной двуцепочечной ДНК и ДНК хромосом или иных форм репаративно-реком6инационного процесса. На модельных организмах мыши и крысы, а также с использованием в качестве исходного материала клеток костного мозга человека 6ыло оценено изменение количества теломерной ДНК в гемопоэтических стволовых клетках как показатель произошедших репарационно-реком6инационных со6ытий. Bо всех проведенных экспериментах в качестве фактора сравнения использовался ангиогенин реком6инантный человеческий. Методом дот-6лот ги6ридизации показано, что в клетках колоний, полученных из клеток костного мозга модельных организмов, а также из клеток о6разцов костного мозга человека, о6ра6отанных препаратом двуцепочечной ДНК, произошло достоверное увеличение количества теломерной ДНК. Амплификация теломерной ДНК в клетках колоний не связана с контаминацией препаратом исходной ДНК, которым о6ра6атывались клетки костного мозга. O6ра6отка клеток костного мозга ДНК, не несущей теломерных последовательностей (AluI ПЦР-фрагмент), не приводит к увеличению количества теломерной ДНК в клетках выросших колоний. Это предполагает участие в амплификации теломерной ДНК экстрахромосомальной ДНК-матрицы, несущей ДНК теломер. Установлено, что о6ра6отка клеток костного мозга ангиогенином также сопровождается увеличением теломерной ДНК в клетках колоний. Сопоставление типа колоний с интенсивностью ги6ридизации (т. е. количества теломерной ДНК в о6разце) предполагало, что увеличение количества детектируемой теломерной ДНК при о6ра6отке ангиогенином и hDNAgr имеет принципиально разное происхождение. Bестерн-6лот анализом и методом ПЦР в реальном времени установлено, что увеличение количества теломерной ДНК при о6ра6отке клеток костного мозга препаратом двуцепочечной ДНК не коррелирует с активностью эндогенной/экзогенной теломеразы. Для ангиогенина показано, что увеличение количества теломерной ДНК может 6ыть результатом активации эндогенной теломеразной активности. Разра6отан принцип амплификации нового генетического признака, пришедшего в гемопоэтические стволовые клетки с экстраклеточным двуцепочечным ДНК материалом и закрепившимся в реципиентном геноме или транзитно присутствующим в клетке в качестве новой генетической информации.

1. Alanazi A.F.R., Parkinson G.N., Haider S. Structural motifs at the telomeres and their role in regulatory pathways. Biochemistry. 2024; 63(7):827-842. doi 10.1021/acs.biochem.4C00023

2. Cech T.R., Lingner J., Nakamura T., Chapman K.B., Morin G.B., Harley C.B., Andrews W.H. Telomerase reverse transcriptase. Patent WO1998/14592.1998.

3. Cesare A.J., Griffith J.D. Telomeric DNA in ALT cells is characterized by free telomeric circles and heterogeneous t-loops. Mol Cell Biol. 2004;24(22):9948-9957. doi 10.1128/MCB.24.22.9948-9957.2004

4. Chan S.W.L., Blackburn E.H. Telomerase and ATM/Tel1p protect telomeres from nonhomologous end joining. Mol Cell. 2003;11(5): 1379-1387. doi 10.1016/S1097-2765(03)00174-6

5. Claussin C., Chang M. The many facets of homologous recombination at telomeres. Microb Cell. 2015;2(9):308-321. doi 10.15698/MIC2015.09.224

6. Cromie G.A., Connelly J.C., Leach D.R.F. Recombination at doublestrand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage tо humans. Mol Cell. 2001;8(6):1163-1174. doi 10.1016/S1097-2765(01)00419-1

7. Dilley R.L., Verma P., Cho N.W., Winters H.D., Wondisford A.R., Greenberg R.A. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 2016;539(7627):54-58. doi 10.1038/nature20099

8. Doksani Y. The response to DNA damage at telomeric repeats and its consequences for telomere function. Genes. 2019;10(4):318. doi 10.3390/genes10040318

9. Dolgova E.V., Nikolin V.P., Popova N.A., Proskurina A.S., Orishenko K.E., Alyamkina E.A., Efremov Y.R., … Taranov O.S., Rogachev V.A., Sidorov S.V., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Internalization of exogenous DNA into internal compartments of murine bone marrow cells. Russ J Genet Appl Res. 2012;2:440-452. doi 10.1134/S2079059712060056

10. Dolgova E.V., Efremov Y.R., Orishchenko K.E., Andrushkevich O.M., Alyamkina E.A., Proskurina A.S., Bayborodin S.I., … Omigov V.V., Minkevich A.M., Rogachev V.A., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Delivery and processing of exogenous double-stranded DNA in mouse CD34+ hematopoietic progenitor cells and their cell cycle changes upon combined treatment with cyclophosphamide and double-stranded DNA. Gene. 2013;528(2):74-83. doi 10.1016/j.gene.2013.06.058

11. Giardini M.A., Segatto M., da Silva M.S., Nunes V.S., Cano M.I.N. Telomere and telomerase biology. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014; 125:1-40. doi 10.1016/B978-0-12-397898-1.00001-3

12. Giraud¬Panis M.J., Pisano S., Poulet A., Le Du M.H., Gilson E. Structural identity of telomeric complexes. FEBS Lett. 2010;584(17): 3785-3799. doi 10.1016/j.febslet.2010.08.004

13. Goncalves K.A., Silberstein L., Li S., Severe N., Hu M.G., Yang H., Scadden D.T., Hu G.F. Angiogenin promotes hematopoietic regeneration by dichotomously regulating quiescence of stem and progenitor cells. Cell. 2016;166(4):894-906. doi 10.1016/j.cell.2016.06.042

14. Hande M.P. DNA repair factors and telomere-chromosome integrity in mammalian cells. Cytogenet Genome Res. 2004;104:116-122. doi 10.1159/000077475

15. Hastings P.J., McGill C., Shafer B., Strathern J.N. Ends-in vs. endsout recombination in yeast. Genetics. 1993;135(4):973-980. doi 10.1093/genetics/135.4.973

16. Henson J.D., Cao Y., Huschtscha L.I., Chang A.C., Au A.Y.M., Pickett H.A., Reddel R.R. DNA C-circles are specific and quantifiable markers of alternative-lengthening-of-telomeres activity. Nat Biotechnol. 2009;27(12):1181-1185. doi 10.1038/nbt.1587

17. Jones C.Y., Williams C.L., Moreno S.P., Morris D.K., Mondello C., Karlseder J., Bertuch A.A. Hyperextended telomeres promote formation of C-circle DNA in telomerase positive human cells. J Biol Chem. 2023;299(5):104665. doi 10.1016/j.jbc.2023.104665

18. Langston L.D., Symington L.S. Gene targeting in yeast is initiated by two independent strand invasions. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101(43):15392-15397. doi 10.1073/pnas.0403748101

19. Lee M., Hills M., Conomos D., Stutz M.D., Dagg R.A., Lau L.M.S., Reddel R.R., Pickett H.A. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 2014;42(3):1733-1746. doi 10.1093/nar/gkt1117

20. Li J., Read L.R., Baker M.D. The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events. Mol Cell Biol. 2001;21(2):501510. doi 10.1128/MCB.21.2.501-510.2001

21. Likhacheva A.S., Rogachev V.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Shilov A.G., Sebeleva T.E., Strunkin D.N., Chernykh E.R., Gel’fgat E.L., Bogachev S.S., Shurdov M.A. Involvement of exogenous DNA in the molecular processes in somatic cell. Informatsionnyy Vestnik VOGiS = The Herald of Vavilov Society for Geneticists and Breeders. 2008;12(3):426-473 (in Russian)

22. Lingner J., Cech T.R. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3′ overhang. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(20):10712-10717. doi 10.1073/PNAS.93.20.10712

23. Loe T.K., Zhou Li J.S., Zhang Y., Azeroglu B., Boddy M.N., Denchi E.L. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML¬dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes Dev. 2020;34(9-10):650-662. doi 10.1101/gad.333963.119

24. Lu R., Pickett H.A. Telomeric replication stress: the beginning and the end for alternative lengthening of telomeres cancers. Open Biol. 2022;12(3):220011. doi 10.1098/rsob.220011

25. Lu W., Zhang Y., Liu D., Songyang Z., Wan M. Telomeres¬structure, function, and regulation. Exp Cell Res. 2013;319(2):133-141. doi 10.1016/j.yexcr.2012.09.005

26. Lundblad V. Telomere maintenance without telomerase. Oncogene. 2002;21(4):522-531. doi 10.1038/sj.onc.1205079

27. Maizels N., Davis L. Initiation of homologous recombination at DNA nicks. Nucleic Acids Res. 2018;46(14):6962-6973. doi 10.1093/nar/gky588

28. Maniatis T., Fritch E., Sambrook D. Methods of Genetic Engineering. Molecular Cloning. Moscow: Mir Publ., 1984 (in Russian)

29. McEachern M.J., Haber J.E. Break-induced replication and recombinational telomere elongation in yeast. Annu Rev Biochem. 2006;75: 111-135. doi 10.1146/annurev.biochem.74.082803.133234

30. Nabetani A., Ishikawa F. Alternative lengthening of telomeres pathway: recombination-mediated telomere maintenance mechanism in human cells. J Biochem. 2011;149(1):5-14. doi 10.1093/jb/mvq119

31. Nandakumar J., Cech T.R. Finding the end: recruitment of telomerase to telomeres. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14(2):69-82. doi 10.1038/nrm3505

32. Pickett H.A., Cesare A.J., Johnston R.L., Neumann A.A., Reddel R.R. Control of telomere length by a trimming mechanism that involves generation of t-circles. EMBO J. 2009;28(7):799-809. doi 10.1038/emboj.2009.42

33. Potter E.A., Proskurina A.S., Ritter G.S., Dolgova E.V., Nikolin V.P., Popova N.A., Taranov O.S., Efremov Y.R., Bayborodin S.I., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Kolchanov N.A., Bogachev S.S. Efficacy of a new cancer treatment strategy based on eradication of tumorinitiating stem cells in a mouse model of Krebs-2 solid adenocarcinoma. Oncotarget. 2018;9(47):28486-28499. doi 10.18632/oncotarget.25503

34. Potter E.A., Dolgova E.V., Proskurina A.S., Ruzanova V.S., Efremov Y.R., Kirikovich S.S., Oshikhmina S.G., … Grivtsova L.U., Kolchanov N.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R., Bogachev S.S. Stimulation of mouse hematopoietic stem cells by angiogenin and DNA preparations. Braz J Med Biol Res. 2024;57:e13072. doi 10.1590/1414-431X2024e13072

35. Rovatsos M.T., Marchal J.A., Romero-Fernández I., Fernández F.J., Giagia-Athanosopoulou E.B., Sánchez A. Rapid, independent, and extensive amplification of telomeric repeats in pericentromeric regions in karyotypes of arvicoline rodents. Chromosome Res. 2011; 19(7):869-882. doi 10.1007/S10577-011-9242-3

36. Rubnitz J., Subramani S. The minimum amount of homology required for homologous recombination in mammalian cells. Mol Cell Biol. 1984;4(11):2253-2258. doi 10.1128/mcb.4.11.2253-2258.1984

37. Ruzanova V.S., Oshikhmina S.G., Proskurina A.S., Ritter G.S., Kirikovich S.S., Levites E.V., Efremov Y.R., Karamysheva T.V., Meschaninova M.I., Mamaev A.L., Taranov O.S., Bogachev A.S., Sidorov S.V., Nikonov S.D., Leplina O.Y., Ostanin A.A., Cher nykh E.R., Kolchanov N.A., Dolgova E.V., Bogachev S.S. A concept of natural genome reconstruction. Part 2. Effect of extracellular doublestranded DNA fragments on hematopoietic stem cells. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov J Genet Breed. 2024;28(8): 993-1007. doi 10.18699/vjgb-24-106

38. Saini N., Ramakrishnan S., Elango R., Ayyar S., Zhang Y., Deem A., Ira G., Haber J.E., Lobachev K.S., Malkova A. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 2013;502(7471):389-392. doi 10.1038/nature12584

39. Sjakste N., Riekstiņa U. DNA damage and repair in differentiation of stem cells and cells of connective cell lineages: a trigger or a complication? Eur J Histochem. 2021;65(2):3236. doi 10.4081/ejh.2021.3236

40. Soman A., Korolev N., Nordenskiöld L. Telomeric chromatin structure. Curr Opin Struct Biol. 2022;77:102492. doi 10.1016/J.SBI.2022.102492

41. Vriend L.E.M., Krawczyk P.M. Nick¬initiated homologous recombination: protecting the genome, one strand at a time. DNA repair. 2017;50:1-13. doi 10.1016/j.dnarep.2016.12.005

42. Wang R.C., Smogorzewska A., De Lange T. Homologous recombination generates t-loop-sized deletions at human telomeres. Cell. 2004; 119(3):355-368. doi 10.1016/j.cell.2004.10.011

43. Wilson M.A., Kwon Y., Xu Y., Chung W.H., Chi P., Niu H., Mayle R., Chen X., Malkova A., Sung P., Ira G. Pif1 helicase and Polδ promote recombination-coupled DNA synthesis via bubble migration. Nature. 2013;502(7471):393-396. doi 10.1038/nature12585

44. Zhang T., Zhang Z., Li F., Hu Q., Liu H., Tang M., Ma W., Huang J., Songyang Z., Rong Y., Zhang S., Chen B.P., Zhao Y. Looping-out mechanism for resolution of replicative stress at telomeres. EMBO Rep. 2017;18(8):1412-1428. doi 10.15252/embr.201643866