Новая комбинация 5’- и 3’-нетранслируемых областей способствует повышению экспрессии мРНК in vitro и in vivo

Технология мРНК-вакцин начала активно развиваться в начале XXI в. и получила хороший стимул за счет расширения знаний о функционировании иммунной системы человека и успехов в синтезе вариантов молекул-доставщиков. Иммунизация с помощью мРНК-вакцин является более эффективной, чем иммунизация с помощью ДНК, благодаря более быстрой разработке, гибкости технологии и отсутствию интеграции в геном. В наши дни искусственные мРНК используют в различных биотехнологических и медицинских целях, включая разработку противовирусных и противораковых мРНК-вакцин. Для их эффективной экспрессии необходимо правильно подобрать структурные элементы мРНК. Помимо добавления в структуру мРНК 5’-кэпа, достаточного уровня полиаденилирования и оптимизации последовательности кодонов, 5’- и 3’-нетранслируемые области (НТО) играют важную роль в трансляционной эффективности терапевтических мРНК. В настоящем исследовании для получения искусственных мРНК были сконструированы плазмидные конструкции, содержащие в своем составе новую комбинацию нетранслируемых областей – 5’-UTR-4 и 3’-UTR AES-mtRNR1. Для новой комбинации НТО, впервые описанной в данной работе, было показано значительное увеличение уровня трансляции кодон-оптимизированных последовательностей репортерных мРНК, кодирующих GFP (зеленый флюоресцентный белок) и FLuc (люцифераза светлячка), содержащих в своем составе псевдоуридин и поли(А)-последовательность. В ходе работы были сформированы комплексы вышеупомянутых репортерных мРНК с липосомами, состоящими из катионного липида 2Х3 (1,26-бис(холест- 5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазогексакозан тетрагидрохлорид) и липида-хелпера DOPE (1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин). Для экспериментов in vivo в состав липосомальной композиции добавляли 2 % 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG₂₀₀₀). Новая комбинация НТО продемонстрировала более высокую эффективность трансляции мРНК в сравнении с β-глобиновыми НТО как in vitro, так и in vivo. При внутримышечном введении мРНК предложенная комбинация НТО обеспечивает длительную экспрессию более четырех суток. Результаты исследования показали высокую эффективность новой комбинации НТО для повышения уровня трансляции искусственных мРНК, что может быть использовано для снижения терапевтической дозы мРНК в составе вакцин. 

1. Andreev D.E., Dmitriev S.E., Terenin I.M., Prassolov V.S., Merrick W.C., Shatsky I.N. Differential contribution of the m7G-cap to the 5ʹ end-dependent translation initiation of mammalian mRNAs. Nucleic Acids Res. 2009;37(18):6135-6147. doi 10.1093/nar/gkp665

2. Chatterjee S., Pal J.K. Role of 5ʹ- and 3ʹ-untranslated regions of mRNAs in human diseases. Biol Cell. 2009;101(5):251-262. doi 10.1042/BC20080104

3. Chen F., Cocaign-Bousquet M., Girbal L., Nouaille S. 5ʹUTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 2022;13:1088941. doi 10.3389/fmicb.2022.1088941

4. Conrad T., Plumbom I., Alcobendas M., Vidal R., Sauer S. Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters. Commun Biol. 2020;3(1):439. doi 10.1038/s42003-020-01167-x

5. Fedorovskiy A.G., Antropov D.N., Dome A.S., Puchkov P.A., Makarova D.M., Konopleva M.V., Matveeva A.M., Panova E.V., Shmendel E.V., Maslov M.A., Dmitriev S.E., Stepanov G.A., Markov O.V. Novel efficient lipid-based delivery systems enable a delayed uptake and sustained expression of mRNA in human cells and mouse tissues. Pharmaceutics. 2024;16(5):684. doi 10.3390/pharmaceutics16050684

6. Gladkikh D.V., Sen’kova A.V., Chernikov I.V., Kabilova T.O., Popova N.A., Nikolin V.P., Shmendel E.V., Maslov M.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A., Chernolovskaya E.L. Folate-equipped cationic liposomes deliver anti-MDR1-siRNA to the tumor and increase the efficiency of chemotherapy. Pharmaceutics. 2021;13(8):1252. doi 10.3390/pharmaceutics13081252

7. Hassett K.J., Rajlic I.L., Bahl K., White R., Cowens K., Jacquinet E., Burke K.E. mRNA vaccine trafficking and resulting protein expression after intramuscular administration. Mol Ther Nucleic Acids. 2024;35(1):102083. doi 10.1016/j.omtn.2023.102083

8. Kirshina A.S., Vasileva O.O., Kunyk D.A., Seregina K.K., Muslimov A.R., Ivanov R.A., Reshetnikov V.V. Effects of combinations of untranslated-region sequences on translation of mRNA. Biomolecules. 2023;13(11):1677. doi 10.3390/biom13111677

9. Kozak M. The scanning model for translation: an update. J Cell Biol. 1989;108(2):229-241. doi 10.1083/jcb.108.2.229

10. Leppek K., Byeon G.W., Kladwang W., Wayment-Steele H.K., Kerr C.H., Xu A.F., Kim D.S., … Participants E., Dormitzer P.R., Solorzano A., Barna M., Das R. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536. doi 10.1038/s41467-022-28776-w

11. Markov O.V., Mironova N.L., Shmendel E.V., Serikov R.N., Morozova N.G., Maslov M.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Multicomponent mannose-containing liposomes efficiently deliver RNA in murine immature dendritic cells and provide productive anti-tumour response in murine melanoma model. J Control Release. 2015;213: 45-56. doi 10.1016/j.jconrel.2015.06.028

12. Morais P., Adachi H., Yu Y.T. The critical contribution of pseudouridine to mRNA COVID-19 vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021;9: 789427. doi 10.3389/fcell.2021.789427

13. Mrksich K., Padilla M.S., Joseph R.A., Han E.L., Kim D., Palanki R., Xu J., Mitchell M.J. Influence of ionizable lipid tail length on lipid nanoparticle delivery of mRNA of varying length. J Biomed Mater Res A. 2024;112(9):1494-1505. doi 10.1002/jbm.a.37705

14. Orlandini von Niessen A.G., Poleganov M.A., Rechner C., Plaschke A., Kranz M.L., Fesser M., Diken M., Lower M., Vallazza B., Beissert T., Bukur V., Kuhn A.N., Tureci O., Sahin U. Improving mRNAbased therapeutic gene delivery by expression-augmenting 3ʹ UTRs identified by cellular library screening. Mol Ther. 2019;27(4):824-836. doi 10.1016/j.ymthe.2018.12.011

15. Panova E.A., Kleymenov D.A., Shcheblyakov D.V., Bykonia E.N., Mazunina E.P., Dzharullaeva A.S., Zolotar A.N., … Dmitriev S.E., Gushchin V.A., Naroditsky B.S., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Single-domain antibody delivery using an mRNA platform protects against lethal doses of botulinum neurotoxin A. Front Immunol. 2023;14:1098302. doi 10.3389/fimmu.2023.1098302

16. Ruiz de los Mozos I., Vergara-Irigaray M., Segura V., Villanueva M., Bitarte N., Saramago M., Domingues S., Arraiano C.M., Fechter P., Romby P., Valle J., Solano C., Lasa I., Toledo-Arana A. Base pairing interaction between 5ʹ- and 3ʹ-UTRs controls icaR mRNA translation in Staphylococcus aureus. PLoS Genet. 2013;9(12):e1004001. doi 10.1371/journal.pgen.1004001

17. Sample P.J., Wang B., Reid D.W., Presnyak V., McFadyen I.J., Morris D.R., Seelig J. Human 5′ UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809. doi 10.1038/s41587-019-0164-5

18. Troy T., Jekic-McMullen D., Sambucetti L., Rice B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Mol Imaging. 2004;3(1):9-23. doi 10.1162/15353500200403196

19. Vysochinskaya V., Shishlyannikov S., Zabrodskaya Y., Shmendel E., Klotchenko S., Dobrovolskaya O., Gavrilova N., Makarova D., Plotnikova M., Elpaeva E., Gorshkov A., Moshkoff D., Maslov M., Vasin A. Influence of lipid composition of cationic liposomes 2X3- DOPE on mRNA delivery into eukaryotic cells. Pharmaceutics. 2022;15(1):8. doi 10.3390/pharmaceutics15010008

20. Yuzhakova D., Kiseleva E., Shirmanova M., Shcheslavskiy V., Sachkova D., Snopova L., Bederina E., Lukina M., Dudenkova V., Yusu­ balieva G., Belovezhets T., Matvienko D., Baklaushev V. Highly invasive fluorescent/bioluminescent patient-derived orthotopic model of glioblastoma in mice. Front Oncol. 2022;12:897839. doi 10.3389/fonc.2022.897839

21. Zhuang X., Qi Y., Wang M., Yu N., Nan F., Zhang H., Tian M., Li C., Lu H., Jin N. mRNA vaccines encoding the HA protein of influenza A H1N1 virus delivered by cationic lipid nanoparticles induce protective immune responses in mice. Vaccines (Basel). 2020;8(1):123. doi 10.3390/vaccines8010123